ABCT 101 · L8 · 結構生物學（上）

🔬 第八講 · 結構生物學（上） Xiuyuan Li · 2026-10-28

四種「看見看不到的東西」的方法：晶體、電子、磁核、與散射的 X 光。每一種買到什麼、付出什麼、回答哪個問題，這一講講清楚。

101 · L8 Structural Biology Part I — Crystallography, Cryo-EM, NMR, SAXS

第八講 · 結構生物學（上）｜Xiuyuan Li · 2026 年 10 月 28 日

ABCT5101 第八講，結構生物學兩部曲的第一部。上半場講四種技術與它們之間的取捨；下週（Part II）是應用與個案，練習任務指向 11 月 18 日。講者說得很清楚：這門課不是要把你訓練成結晶學家，而是讓你能選對技術、帶得動專案—— 用他的話，是「strategic decision-making」。

必須記住的數字

項目	數值	為什麼重要
光學顯微鏡極限	~200 nm（0.2 µm）	可見光 400–750 nm，再小就要換探針
X 光：低解析度	> 3.0 Å	只看整體外形，沒有原子細節
X 光：中／高解析度	2.5–3.0 Å／2.0–2.5 Å	2.0–2.5 開始看到側鏈；結構水與金屬離子可能出現
X 光：原子級	< 1.5 Å	看得到單一原子與精確鍵長
Cryo-EM 解析度	2–3 Å	2013 年之後才成為常規
Cryo-EM 甜蜜點	> 150 kDa	更小的蛋白要靠 phase plate 等特殊手段
所需蛋白量	X 光 1–10 mg、cryo-EM 0.1–1 mg、NMR > 5 mg（mM 級）、SAXS 0.1–0.5 mg	任何專案的第一道門檻都是「你做得出多少蛋白」
NMR／SAXS 尺寸上限	NMR < 30 kDa、SAXS > 10 kDa	NMR 與 cryo-EM 在尺寸上幾乎互補
Cryo-EM 產出速率	~300 movies／小時	決定一次收數據的真實成本
諾貝爾獎	2017 化學獎	cryo-EM 正式成為主流方法的分水嶺

1 Å = 0.1 nm = 100 pm。Å 數字愈小＝解析度愈高——這個反直覺方向是考試最愛設的坑。

1 · 「結構」到底買到什麼

結構不是一張圖，而是「解釋行為的排列方式」。

講義刻意從生物學以外開始。結構的定義是系統各部分被排列、被組織的方式。它之所以重要，在工程、地質、科學、社會研究裡是同一個理由：一旦知道排列，就能解讀系統、預測結果、把知識跨領域搬用。deck 用的例子是寒武紀鹽盆地的構造框架。

結構生物學把這個想法套到生命材料上——由活細胞形成、組成、維持、修飾——而且涵蓋每一個組織層級。它在臨床上的理由是最老的那一條：功能追隨形態。有了結構，你才知道哪些殘基彼此接觸、配體佔哪個口袋，因此突變或藥物會造成什麼後果。

十秒版 序列告訴你蛋白由什麼組成，結構告訴你它在做什麼。機制、抗藥性、可成藥性，全部是從排列讀出來的。

2 · 「看見」其實是建模，不是光子

200 nm 以下你看不到物體本身，你看到的是從數據推出來的模型。

光學顯微鏡停在約 0.2 µm——看得到線粒體與細菌，看不到分子。兩道牆：繞射極限 （可見光 400–750 nm，小於 ~200 nm 就解不開）與光子損傷（要更高解析度就得用更強的光，樣本就先被打壞）。

講義接著重新定義「看見」。模型才是讓人理解與詮釋結構的東西；好的模型要 (i) 抓住所有關鍵元素與關係、 (ii) 可驗證且可預測、(iii) 簡單到能溝通。這就是 scientific constructivism：科學家是靠從實驗數據建出的模型 去「看見」蛋白結構，而不是真的看到它。

為什麼這個框架對考試重要這一講的每一種技術，本質上都是收集間接證據、再把模型擬合上去。所以四種技術的產出都是「模型＋驗證統計」—— 也因此，不知道解析度與 R factor 就說自己「看見」了結構，等於沒看見。

3 · X 光結晶學：原理與解析度階梯

晶體給你秩序，X 光給你繞射，數學給你電子密度。

三個概念，按順序。秩序：晶體是分子呈長程、有序排列的固體——正是這個重複的晶格，把散射變成尖銳的繞射點。繞射：高能 X 光穿過晶體後散射，遵循 Bragg's Law。反演：繞射圖案經數學轉換成電子密度圖，再把分子模型擬合進去。

解析度是這裡唯一的貨幣，講義給成階梯：

解析度	能下什麼結論
> 3.0 Å	低——只有整體外形，沒有原子細節
2.5–3.0 Å	中——大致結構，部分側鏈資訊
2.0–2.5 Å	高——側鏈與交互作用清楚；結構水、金屬離子可能出現
< 1.5 Å	真正的原子級——單一原子與精確鍵長

在高解析度下，這個方法回答的是產業真正付錢的問題：藥物怎麼結合？講義舉的是兩個資料庫—— 已知酵素機制彙編（M-CSA）與 PDB 的配體／座標紀錄。

考試要點沒有方法和解析度的數字，不構成結構主張。看到「某物的結構」時，第一個問題永遠是 什麼方法、多少 Å。

4 · 流程七步，以及專案真正死在哪裡

七個步驟；第一步就吃掉九成的時程。

步驟	做什麼	失敗模式
0 · 樣本製備	純化生物分子；以大腸桿菌或哺乳動物細胞重組表現，可加 tag	產量、純度、異質性
1 · 結晶	在可控條件下長出高品質晶體	真正的瓶頸——有些蛋白永遠長不出來
2 · 收數據	照射 X 光、記錄繞射	輻射損傷、晶體有序度不足
3 · 資料處理	積分繞射點 → 電子密度圖	統計不好，後面全毀
4 · 建模	把分子模型塞進密度圖	對噪聲過度擬合
5 · 修正	迭代縮小觀測與計算密度的差異（如 Phenix）	修進錯誤的盆地
6 · 驗證	R factor、Ramachandran 圖、鍵長	跳過——模型「可以發表」但是錯的
7 · 上交	PDB／EMDB；驗證報告、條件、軟體、來源；取得 accession code	無法被引用、無法被重現

注意多少環節已經自動化：資料處理與建模大多由軟體完成，所以人的判斷集中在第 0–1 步 （我做得出蛋白嗎？長得出晶體嗎？）與第 6 步（這個答案是真的是假的）。

一筆 PDB 紀錄裡到底有什麼 Accession code、序列、結合的配體與輔因子、方法與解析度、對稱性與晶胞、三個 R 值—— R-work（對修正用數據的擬合）、R-free（獨立檢驗）、R-observed（整體一致性）。要引用結構，就引 R-free。

5 · 結晶：決定專案生死的那一段

你是在逼一個分子放棄它偏好的狀態、排進晶格。

小分子容易結晶——蒸發、降溫、有機溶劑。大分子不行：需要高純度、可控條件、專門方法。經典配方是緩衝液（pH 維持穩定）＋鹽（硫酸銨降低溶解度）＋沉澱劑（PEG 逐步脫水）。

四種標準技術：蒸氣擴散（懸滴懸在儲液上方、座滴放在旁邊，兩者都靠緩慢蒸發）、 microbatch（在油下混合、不蒸發）、microdialysis（對沉澱劑透析）。現代實務再加上 商業篩選套組、機器人分注（每條件可低到 ~100 nL）、自動顯微鏡判讀、細篩（pH／濃度／溫度）與 seeding（把碎晶引入新液滴，誘導長得更好更大）。

複合物才是有意思的部分。蛋白–配體有兩條路：共結晶（先加配體）或 soaking（先把晶體長好、再泡進配體溶液）；限制是結合親和力、蛋白與配體的比例、以及複合物的穩定化。蛋白–蛋白或蛋白–核酸的難題換成複合物穩定性、大型組裝的柔性、以及化學計量比——有時要靠融合蛋白硬拉。

反直覺的事實純度有幫助但不是絕對：史上第一個被記錄的蛋白晶體是 1840 年蚯蚓血裡的血紅素，而且有些蛋白在活細胞內就結晶（in cellulo）。「先求純度」是為了產能，不是教條。

6 · Cryo-EM：為什麼 2013 年改變了一切

和光學顯微鏡同一套物理，只是把光子換成電子。

Cryo-EM 1980 年代就有了，但長期被叫 blobology——只看得出模糊形狀。2013 年後能做到原子級，靠三件事： 直接電子偵測器（靈敏度與對比提升）、更好的影像處理演算法（平均數千張影像以克服噪聲與輻射損傷）、以及低溫載台穩定性（位移更小、影像更銳利）。2017 年諾貝爾化學獎是它進入主流的標誌。

儀器本體：以電子束當「光」、以磁線圈當透鏡、全程高真空；成像是靠彈性散射電子 ——方向改變但能量不變的那些，它們才攜帶結構資訊。

元件	值得知道的細節
Grid	約 3 mm 圓片；銅、鎳或金；mesh 200／300／400（每吋格數）；碳膜或孔洞碳膜；glow discharge 讓表面親水
玻璃化	投入液態乙烷；控制濕度避免結冰污染；不用固定劑與染色，保住天然構象，也降低輻射損傷
樣本容忍度	純度要求不嚴；0.1–5 mg/mL；避免高濃度添加物——比結晶學友善得多
厚樣本	電子穿透力差——細胞要先以 FIB 銑削（如 Aquilos 2）把目標區域削薄
取像	低劑量搜尋（atlas → squares → holes），再高倍取像；movie mode 配合運動校正；自動收集可達 ~300 movies／小時

為什麼單一分子的影像不夠：生物樣本散射弱（C、N、S、O、H 對比水），對比天生就低；就算凍住，輻射損傷仍在。解法是統計——假設族群同質、收大量數據、分類與對齊、然後平均。細節是從平均裡長出來的，不是從任何一張影像。

處理流程：micrographs → 挑粒子 → 2D 分類與平均 → CTF 校正 → 初始 3D 模型 → 3D 分類與修正 → 後處理與驗證。講義給的標竿：β-galactosidase 3.2 Å（Bartesaghi 2014）、 GroEL 3.5 Å（Roh 2017）。

一句話記住 Cryo-EM 不是拍分子，是把幾千張帶噪聲的影子平均到分子浮現。而「這些粒子都一樣」這個假設，正是你要主動質疑的地方。

7 · NMR 與 SAXS：兩個專科醫生

NMR 給溶液中的動態，SAXS 給溶液中的形狀——兩者都不需要晶體。

NMR 利用原子核（¹H、¹³C、¹⁵N）在強磁場中的磁性：吸收與放出射頻能量，訊號對原子核所處的化學環境極度敏感，能給出約 5 Å 內的距離與鍵角資訊。它的地盤是 小蛋白（< 30 kDa）的溶液結構、即時動態與交互作用，以及在接近生理條件下不破壞樣本。代價是尺寸上限、譜圖複雜、需要 mM 級濃度且極純的樣本、以及昂貴的高場儀器——這就是為什麼後來被 cryo-EM 與結晶學吃掉大半版圖。

SAXS 在溶液中量小角 X 光散射，得到尺寸、形狀與構象。它明確是低解析度技術，蛋白用量極少（0.1–0.5 mg），但對聚集極度敏感——所以標準做法是與 SEC 連線，只有乾淨的單體會進到光束裡。

兩個值得細看的個案：de novo 設計的跨膜蛋白，NMR 結構（PDB 9FDG）與晶體結構（8UZL）都與計算設計吻合（Berhanu et al., Science 2024）——兩種獨立技術互相驗證一個設計；以及 JACS 2018 用 SAXS 區分同一分子在溶液中的不同構象。

怎麼選按順序問三件事：多大（>150 kDa 走 cryo-EM；<30 kDa 走 NMR；能結晶就走 X 光）、 做得出多少蛋白（cryo-EM 與 SAXS 的材料成本低一個量級）、你要動態還是快照 （溶液行為與柔性看 NMR／SAXS）。

8 · 真正會用到的決策表

四種技術一張表——這頁值得拍照。

技術	解析度	所需蛋白	適用尺寸	強項	弱項
X 光	可達 1.0 Å	1–10 mg	小分子到大複合物	原子級細節；藥物結合與機制	結晶慢且可能永遠長不出來；只有靜態快照
Cryo-EM	可達 2–3 Å	0.1–1 mg	最佳 >150 kDa	不需晶體、保留天然構象；膜蛋白與大型組裝	受純度與同質性限制；處理重、儀器貴
NMR	無固定空間解析度	mM 級、> 5 mg	< 30 kDa	接近生理條件下的動態與交互作用	需同位素標記；濃度高；譜圖複雜
SAXS	低，只有形狀	0.1–0.5 mg	> 10 kDa	溶液構象；柔性分子；材料成本極低	沒有原子細節；必須搭配其他技術

全講最可考的一個觀念 cryo-EM 與 X 光不是替代品，而是失敗模式不同的互補品。結晶學死在「晶體」，cryo-EM 死在「同質性」。若目標是異質、柔性、膜嵌入、而且材料充足——選 cryo-EM；若是剛性的 40 kDa 酵素、你要 1.5 Å 的配體構象 ——選結晶學。

9 · 外包：你真正要做的決定

表現、純化、結晶都成熟到可以買——判斷力買不到。

講義明說這一段談的是technological leadership，不是手工技術。蛋白表現、純化、結晶已成熟到可 外包給 CRO；專業公司約兩週就能交出高純度、有活性的蛋白，成本常常更低，讓研究團隊專注在結構分析。

決策	你在選什麼
表現系統	大腸桿菌／酵母／昆蟲／哺乳動物——取決於是否需要後轉譯修飾；cell-free 用於快速篩選與難做的靶
Tag	His／Strep／GST 方便純化，但可能干擾結構與結晶，所以蛋白酶切位（TEV、thrombin、3C）要一開始就規劃
密碼子優化	每個宿主都有密碼子偏好；罕用密碼子會默默吃掉你的產量
純化策略	親和 → 離子交換（依 pI 選陽／陰離子交換）→ 尺寸排除；高純度通常要組合拳
驗證	SDS-PAGE（純度）、IEX（電荷狀態）、SEC（摺疊／聚集）、MS（身分與修飾）、活性測定（功能）
供應商管理	依專長分給多家 CRO；任務同步；定期回報——這才是真正的領導工作

為什麼這題在商業化學位裡結構生物學已經變成服務市場：差異化不再是儀器，而是「哪個實驗能回答這個問題」的判斷。這與 NGS 是同一個位移——定序儀是商品，問題不是。

10 · 下一講（11 月 18 日）前的練習

四件事，也是 Part II 聽得懂的前提。

安裝 PyMOL（pymol.org），做完教學——下週上課會直接用。
略讀 paper 1，看作者怎麼表現與結晶 NDM-1。
讀 paper 2，看 benzylpenicillin、oxacillin、methicillin、meropenem 的共晶結構怎麼取得，再用 PyMOL 把結合的小分子畫出來。
讀一篇最早的 SARS-CoV-2 spike cryo-EM 結構報告。

講義列出的資源：RCSB PDB（rcsb.org）、M-CSA 酵素機制（EBI）、UniProt、Caltech cryo-EM 課程、 cryoem101.org、SSRL SAXS 工作坊教材。

11 · 個案：兩個「結構改變決定」的故事

個案	結構看到什麼	決定了什麼
Gleevec（imatinib）與 c-Abl 激酶	藥物結合在 ATP 位址旁的非活性構型口袋，把激酶鎖在「關」的形狀	從「抑制活性」變成「鎖住構型」——這是結構資訊直接產生藥的範例，也解釋了為何某些突變（T315I）會失效
PD-1 與抗體複合體	抗體結合在 PD-1 的配體結合面，擋住 PD-L1 的接觸面	證明「阻斷」不一定要模擬配體，只要佔住同一塊表面即可；也說明表位（epitope）選擇比親和力更關鍵

考點這兩個案例回答同一個問題：「有結構之後，你能做什麼決策？」——一個是「設計形狀選擇性」（Gleevec），一個是「選對表位去阻斷界面」（PD-1）。

12 · 模型驗證：結構不是「看起來對」就好

解出電子密度圖之後，要把胺基酸一條條建進密度裡（model building），再反覆修正（refinement）。驗證（validation）就是問：這個模型有多可信？

指標	看什麼	直覺
R-factor / R-free	模型預測的繞射強度與實測的差距；R-free 用未被擬合的資料，避免「過度fit」	像考試的「未見過題目」分數——R-free 高代表模型只是記住了訓練資料
Ramachandran plot	主鏈二面角是否落在允許區	檢查「骨頭有沒有折到不可能的角度」
B-factor（溫度因子）	哪些區域鬆動、無序	愈高愈「晃」，代表那段本來就不固定
密度吻合度	側鏈是否真的落在密度裡	不能「把模型硬塞進去看起來像」

易錯「解析度越高就一定越可信」——不一定。要看R-free、Ramachandran 與密度吻合；2.5 Å 但驗證良好的模型，可以比 1.8 Å 但 fit 過度的模型更可信。

13 · PDB：做完要交出來，別人才用得到

模型與結構因子最後要存進 Protein Data Bank（PDB），拿到一個 4 字元的 ID（例如 1IEP 就是 Gleevec–Abl 的經典結構）。PDB 同時收 coordinates 與 structure factors，所以任何人都可以重新驗證你的模型，而不是只看一張圖。

為何要記 PDB 結構生物學的產出不是「一張漂亮的圖」，而是可被重複檢驗的資料。考試問「如何分享結構」，答 PDB deposition + 公開 coordinates／structure factors，而不是「寄給合作者」。

投影片另外列出的四個實務手段（原筆記未收）：坐滴（sitting-drop）與懸滴同屬蒸氣擴散，只是滴的位置不同；商業篩選 kit 提供預混條件；結晶機器人做高通量篩選；fine screening 在初篩命中後微調 pH、沉澱劑濃度與溫度。

四種技術的硬性限制（投影片 p60–p74，原筆記未收）

技術	解析度	樣品需求	硬限制
X-ray	原子級（<1.5 Å 可到）	需高品質晶體；蛋白量 mg 級	晶體難長（膜蛋白最難）；靜態快照；晶體堆疊可能造成假象
Cryo-EM	2–3 Å（2013 後）	需均勻樣品；grid 上冷凍；厚樣品要 FIB 削薄	電子穿透力弱、輻射敏感；低對比；需大量粒子做 2D／3D 分類與平均
NMR	溶液態、原子級	蛋白通常 <30 kDa；需 15N／13C 標記；濃度 mM	大蛋白訊號重疊；昂貴；難解多維譜
SAXS	低解析度（整體形狀）	溶液樣品；常需 SEC 去除聚集	只給 envelope、不給原子細節；易受聚集干擾

Cryo-EM 的六步流程：vitrification（液態乙烷急速冷凍）→ grid → 成像（direct electron detector）→ 2D classification → 3D reconstruction → averaging 提升解析度。2013 年後才到原子級，靠的是直接電子偵測器、影像處理演算法與載物台穩定三件事。

PDB 條目的五項資訊：① PDB code；② 序列／配體／突變；③ 實驗參數（方法、解析度）；④ 驗證指標（R-factor、Ramachandran）；⑤ 視覺化。Cryo-EM 結構另存 EMDB。

一句話結構不是照片，是模型＋驗證統計；晶體看原子細節、cryo-EM 看大而異的組裝、NMR 看動態、SAXS 看形狀——選技術的本質是選材料量 × 解析度 × 動態三者之間的取捨。