📚 第四講 · Genomics & Bioinformatics Prof. Quanhua Mu · 2026-09-23
基因組學三問——讀、懂、改。每個平台、檔案格式與工具，都屬於其中一問。
101 · L4 Genomics & Bioinformatics — From Reads to Gene Therapy
Master Logic · 主線邏輯
Master Logic · 主線邏輯基因組學三問 —— 讀（read）、懂（understand）、改（edit）。本講每個平台、檔案格式與工具都剛好屬於其中一問；記住三問，工具清單就變成地圖，而非一堆名。
Genomics asks three questions — read, understand, edit. Every platform, file format and tool in this lecture belongs to exactly one of them; the three questions turn the tool list into a map.
Genomics asks three questions — read, understand, edit. Every platform, file format and tool in this lecture belongs to exactly one of them; the three questions turn the tool list into a map.
Lecture 4 · Genomics & Bioinformatics 基因組學與生物資訊（Prof. Quanhua Mu）
- ABCT5101 第四講，講者 Prof. Quanhua Mu（ABCT，quanhua.mu@polyu.edu.hk）
- 這一講最貼近你日常做的工作 → 選平台、檔案格式、軟體、以及資料能講到什麼、不能講到什麼
- 開場用五個問題定位整堂 → 每個問題都對應後面一個技術
| Question | 中文邏輯 |
|---|---|
| Where did human beings originate? | 對應 phylogenetics／比較基因組 |
| Why do monkeys have long tails while humans do not? | 對應比較基因組、gene annotation |
| Why do some people get sickle cell anemia? | 對應 germline variant、單基因遺傳 |
| How can we diagnose Down syndrome? | 對應 CNV、非侵入性篩查 |
| What are the drivers of chronic myeloid leukemia, and how can we treat it? | 對應 gene fusion、靶向治療 |
Genomics 三問 —— read / understand / edit
Genomics 三問——read / understand / edit：每個工具只答其中一問。
- Genomics = the study of genomes → 整堂課按三個問題切開
- ① What is the sequence? → to read
- ② What does the sequence mean? → to understand
- ③ How to modify the sequence? → to edit
Structure of the lecture
Read（Part 1）= 測序技術、FASTQ、assembly、alignment。Understand（Part 2）= annotation、variant、CNV、fusion 及其臨床意義。Edit（Part 3）= CRISPR 與已批基因治療。
任何一個知識點，先問它屬於哪一問 —— 就定位到講義哪一段。
任何一個知識點，先問它屬於哪一問 —— 就定位到講義哪一段。
The Human Genome Project 與成本崩塌
HGP：3 Gb、$3B、13 年；今日測一個基因組只需幾百美元——成本跌得比摩爾定律快。
| Fact | 中文邏輯 |
|---|---|
| Genome size | 3 billion base pairs（3 Gb） |
| Project cost | 3 billion US dollars |
| Published | Nature, 2001 |
| 下一張 slide | Sharp decrease of sequencing cost → 整個產業的經濟故事就在這一頁 |
Real-world hook
$3B / 3 Gb 是基因組學最常被引用的一組數字，但它同時是商業事實：$3 億級入場成本＝政府項目；$1,000 級入場成本＝臨床產品。
這行業所有商業模式（NIPT、腫瘤 panel、族群篩查）都活在這兩個數字之間的落差裡。
這行業所有商業模式（NIPT、腫瘤 panel、族群篩查）都活在這兩個數字之間的落差裡。
Sequencing Technologies 測序技術 —— 與如何選
按讀長與準確度選：Illumina 短而準；PacBio／Nanopore 長而噪。
| Technology | 中文邏輯 |
|---|---|
| Sanger sequencing | 原始方法 → 至今仍是準確度參考 |
| NGS（Next generation sequencing） | 短讀長、大規模並行 → 主力 |
| PacBio long-read | 長讀長 |
| Nanopore long-read | 長讀長 |
| BGI DNB-Seq | 點名於「features of different sequencing technologies」那頁 |
| BGI Cyclone-seq | 同一頁點名 |
講義不止列平台 → 它出了一道課堂討論題：「Choose the most proper sequencing platform(s) — discuss with your neighbour」，然後給出真正的答案：
Exam focus
「In reality, one sequencing project may combine multiple sequencing techniques.」
考點不是「哪個平台最好」，而是：平台選擇由問題驅動，而真實項目會混用多種技術。
考點不是「哪個平台最好」，而是：平台選擇由問題驅動，而真實項目會混用多種技術。
FASTQ 與品質檢查
FASTQ 每條 read 四行；第四行必須與第二行等長；Q30 = 99.9%。
不論哪個平台，原始輸出都要讀得懂 → FASTQ 四欄結構：
| Field | 中文邏輯 |
|---|---|
| 1 | 以 @ 開頭 → sequence identifier + 可選描述 |
| 2 | 原始序列字母 |
| 3 | 以 + 開頭 → 可選描述 |
| 4 | Field 2 的 quality values → 字元數必須等於序列字母數 |
- 第一個要跑的工具 → FastQC，講義形容為「a simple and useful quality check tool」
兩條流程 —— De novo vs Re-sequencing
De novo 組裝（無參考）vs re-sequencing（貼回參考）。
| De novo genome sequencing | Re-sequencing（against reference） | |
|---|---|---|
| Steps | Sequencing → reads → QC and cleaning → genome assembly → genome sequence → gene annotation → further analysis | Sequencing → reads → QC and cleaning → mapping → variant detection → gene prediction → further analysis |
| 典型用途 | 新物種的基因組 | 人類腫瘤的基因組 |
De novo assembly 兩個關鍵概念 → K-mer 與 De Bruijn graph-based assembly。組裝軟體表要背，因為選擇標準是讀長：
| Assembler | 讀長類型 | 中文邏輯 |
|---|---|---|
| SOAPdenovo | NGS（short reads） | 多物種 |
| SPADES | NGS（short reads） | 主要原核生物 |
| MEGAHIT | NGS（short reads） | 主要 metagenome |
| Flye | TGS（long reads） | 長讀長組裝 |
| canu | TGS（long reads） | 長讀長組裝 |
Reference Genome 與檔案格式
參考基因組（hg19／hg38）與格式鏈：FASTQ → SAM/BAM → VCF。
| Item | 中文邏輯 |
|---|---|
| FASTA | 副檔名 .fasta／.fa／.fna／.faa，例如 hg19.fa |
| 人類基因組組裝版本 | 講義分「old（and rarely used）versions」與「current versions」 |
| 下載點 | UCSC（hgdownload.soe.ucsc.edu，hg38 bigZips）／NCBI（GCF_000001405.26） |
| 其他物種 | UCSC downloads 頁、NCBI datasets |
Comparing Genomes —— Phylogenetics／SNP／GWAS
比較基因組三件事：親緣演化（phylogenetics）、SNP、GWAS。
- Phylogenetics → 跨物種比較基因組；講義用例＝SARS-CoV-2 的 phylogeny
- 重點 → phylogeny 是由序列建的，不是由 phenotype 建的
- SNP（single nucleotide polymorphism）→ 人類變異的底層材料（引 Science, 2008）
- GWAS → 比較 case cohort vs control cohort；參考資料庫＝EBI GWAS catalog
從 Genome 到 Gene —— Annotation
Annotation 把座標變成基因：SnpEff、ANNOVAR。
- 一個容易漏掉的重點 → 模式生物的 gene annotation 早於 NGS 存在；當年用 genetic mapping 在果蠅等模式系統定位基因
- 那個年代發現的基因多以功能命名，通常由發現者命名 → 有些名字很搞笑
- 講義的評語 → gene names are important；你若發現新基因，可以自己提名字
| Task | 中文邏輯 |
|---|---|
| 瀏覽基因／對位結果 | IGV（igv.org）；基因紀錄用 GeneCards（示例 PD-1／PD-L1） |
| 註解新基因組 | 方法＝相似性搜尋，在現有資料庫找最相似的基因序列；工具 BLAST |
| 大規模註解 | 本地跑 BLAST，或用 DIAMOND |
| 已發佈註解 | NCBI datasets、Ensembl FTP（current_gtf）；人類註解用 GTF／GFF3（Ensembl、GENCODE） |
Exam focus —— 三個數字
人類基因組 ~3 Gb；protein-coding genes ~20,000；coding genome ~50 Mb。
算一下 → coding 部分約佔全基因組 1.6%。這正是為什麼「非編碼變異」在後半段變成難題。
算一下 → coding 部分約佔全基因組 1.6%。這正是為什麼「非編碼變異」在後半段變成難題。
- 輕鬆一段 → 「The lost tail of the human」（Nature, 2024）→ 用分子層面回答開場那條「猴子尾巴」問題
你到底測了多少 —— WGS／WES／Targeted
你到底測多少：WGS 最廣最淺；panel 最窄最深最平。
| Approach | 中文邏輯 |
|---|---|
| WGS（Whole genome sequencing） | 全部 → intron、exon、以及其間所有東西 |
| WES（Whole exome sequencing） | 只有 exon |
| Targeted sequencing | 指定區域 → 先做 target enrichment 再測序 |
Real-world hook
WGS / WES / targeted 的選擇，同時是科學決定、成本決定、產品決定——這是整份 deck 最貼近商業核心的一頁。
Alignment 與 Variant Calling
比對（BWA／minimap2）→ 找變異（germline 用 GATK、somatic 用 Mutect2）。
| Step | 中文邏輯 |
|---|---|
| DNA alignment | BWA／BOWTIE2／MINIMAP2 |
| 檢視對位結果 | 格式 SAM／BAM |
- Variant 按來源分 → germline／de novo／somatic
- 講義用鐮刀型貧血的遺傳作 germline 單基因病的示範
- 變異類型 → mutation、insertion、SNV、deletion、tandem repeats、aneuploidy
- 偵測方法分四族 → heuristic／statistical／deep learning／graph models
Variant 實際做什麼 —— Coding vs Non-coding
編碼區變異可解讀；非編碼多數未知——TERT promoter 是例外。
| Coding mutations | Non-coding mutations | |
|---|---|---|
| 效果 | 可由讀框預測 → missense；indel 通常造成 frameshift | 絕大多數功能仍未知，極少例外 |
| 命名例外 | — | TERT promoter mutation（多種癌症） |
| 註解工具 | SnpEff／ANNOVAR | — |
The asymmetry 不對稱
Coding variation 大致上可解（frameshift 就是 frameshift）；non-coding variation 大致上未解。
這就是為什麼佔全基因組約 1.6% 的 coding 部分拿到絕大多數注意力。
這就是為什麼佔全基因組約 1.6% 的 coding 部分拿到絕大多數注意力。
| Concept | 中文邏輯 |
|---|---|
| Tumour mutation burden（TMB） | 腫瘤突變總量 → 引 Nature 2013／NEJM 2017 → 是 biomarker，因此是臨床決策點 |
| TP53 | Tumour suppressing gene → loss of function |
| KRAS | Oncogene → gain of function |
Memory hook
TP53 = 剎車壞掉（loss of function）；KRAS = 油門卡住（gain of function）。 兩個字記住兩種致癌邏輯。
Risk Allele／Tandem Repeat／EGFR T790M
串聯重複：HTT <27 正常、40+ 致病；T790M 是耐藥突變。
- Risk allele frequencies and effect sizes → 兩者關係圖；推論＝常見變異通常效果小，罕見變異可能效果大
- 個案：germline EGFR T790M 與肺癌風險（引 Science, 2026）→ 一個原本與抗藥相關的 germline 變異，在此作為易感因子出現
- Tandem repeat expansion → 示例 HTT（Huntington's disease）：<27 repeats = normal、40+ repeats = disease（引 Lancet, 2007）
- 注意形態 → 同一 locus、同一機制，表型純粹由重複次數決定
Copy Number 與 Structural Variation
CNV 用讀深算：log2 = 0 相等、+1 兩倍、−1 一半。
必記定義
Log2 ratio = the normalized read depth in the case sample over the control sample.
→ CNV calling 本質上是一個讀深（read depth）運算；這解釋了為什麼它能在任何平台上做，也解釋了為什麼normalisation 出錯就是全盤錯。
→ CNV calling 本質上是一個讀深（read depth）運算；這解釋了為什麼它能在任何平台上做，也解釋了為什麼normalisation 出錯就是全盤錯。
| Citation | 中文邏輯 |
|---|---|
| Lo et al., Lancet 1997; BMJ 2011 | 孕婦血漿中 cell-free DNA 的奠基工作 → 即 NIPT（非侵入性產前檢測）那條線，也正是講義開場「如何診斷 Down syndrome」的答案 |
| TCGA, 2013 | 大規模癌症 copy number landscape |
| Nature Genetics, 2022 | 後續 CNV 分析 |
- Structural variations 獨立一類（引 Chromosome Research, 2022）
Gene Fusion —— 最清楚的藥物靶向成功故事
基因融合源自易位；BCR-ABL1 → imatinib 是最乾淨的靶向故事。
Translocation／gene fusion 佔講義一個 multi-slide 區塊，理由是商業性的 → 基因組發現變成藥，就發生在這裡。
- 圖示用 Imatinib（Gleevec®） → 由 fusion 驅動的癌症，用抑制 fusion 產物的方式治療
- Fusion 按組織分類 → haematological／soft tissue／epithelial
- epithelial 之內，講義標示範圍為 rare → common（引 Genome Medicine, 2015）
- 靶向參考 → OncoKB（actionable genes）
| Detection | 中文邏輯 |
|---|---|
| Sequencing-based | INTEGRATE／STAR-fusion／ARRIBA／CICERO，以及 many others |
| Non-sequencing | PCR-Sanger sequencing、nucleotide hybridisation |
Real-world hook
Gleevec 是每個 biopharma 人都應該背得出的案例 → 一個染色體重排定義出病人亞群 → 針對該重排產物設計分子 → 結果把一個致命白血病變成可管理的慢性病。
之後每一個「靶向治療」的融資簡報，都是抄這個模板；companion diagnostics 之所以成為一門生意，也是因為這件事。
之後每一個「靶向治療」的融資簡報，都是抄這個模板；companion diagnostics 之所以成為一門生意，也是因為這件事。
這個 Lab 自己的貢獻
這個 Lab 的貢獻：MET exon 14 skipping（Cell 2018）、MGMT fusion（Nat Commun 2020）。
- 講義在 variant 段收尾用兩頁 「Our works」 → 引 Cell 2018 與 Nature Communications 2020
- 分別是 secondary glioblastoma 的 MET exon 14 skipping，以及驅動 temozolomide 抗藥的 MGMT gene fusion
- 就算不考 → 這頁告訴你一件有用的事：講者做的正是這一講在講的那類問題
Genome Editing 與 Gene Therapy
Untargeted vs targeted 編輯；基因治療 $0.85M–$4.25M——一次過買斷。
最後一段回答第三問 —— 如何修改基因組。
| Concept | 中文邏輯 |
|---|---|
| Untargeted mutagenesis | 隨機損傷 → 無法控制位置 |
| Targeted genome editing | 在選定位點切割或改寫 |
| CRISPR-based genome editing | targeted editing 的機制 |
| 設計 guide | sgRNA 設計 → 講義指向 Broad Institute 的 CRISPick |
然後講義落到商業終點 → 已批基因治療 + 價格。這張表值得整份記住，因為它是「一次性基因治癒要多少錢」目前最清楚的圖像。
| Product | Manufacturer | Price (USD) | Disease | Gene |
|---|---|---|---|---|
| ADSTILADRIN | Ferring | — | 膀胱癌 | IFNα2b |
| BEQVEZ | Pfizer | $3.5 million | Haemophilia B | F9 |
| CASGEVY | Vertex | $2.2 million | 鐮刀型貧血 | BCL11A |
| ELEVIDYS | Sarepta Therapeutics | $3.2 million | Duchenne 肌肉萎縮 | DMD |
| HEMGENIX | CSL Behring | $3.5 million | Haemophilia B | F9 |
| LENMELDY | Orchard Therapeutics | $4.25 million | MLD | ARSA |
| LUXTURNA | Spark Therapeutics | $0.85 million | 視網膜營養不良 | RPE65 |
| LYFGENIA | bluebird bio | $3.1 million | 鐮刀型貧血 | HBB |
| ROCTAVIAN | BioMarin | $2.9 million | Haemophilia A | F8 |
| SKYSONA | bluebird bio | $3 million | CALD | ABCD1 |
| VYJUVEK | Krystal Biotech | — | DEB | COL7A1 |
| ZYNTEGLO | bluebird bio | $2.8 million | β-thalassaemia | HBB |
| ZOLGENSMA | Novartis | $2.1 million | SMA | SMN1 |
把價格欄當成一張商業模式清單來讀
單次治療從 $0.85M 到 $4.25M，而約一半落在 $3M 附近。
另注意兩件事 → bluebird bio 出現三次；F9 出現兩次（BEQVEZ 與 HEMGENIX，同為 Haemophilia B，同為約 $3.5M）。
含義：同一個基因可以被互相競爭的產品攻擊，而一次性治癒的定價必須對照「一輩子的 factor 補充治療」。
另注意兩件事 → bluebird bio 出現三次；F9 出現兩次（BEQVEZ 與 HEMGENIX，同為 Haemophilia B，同為約 $3.5M）。
含義：同一個基因可以被互相競爭的產品攻擊，而一次性治癒的定價必須對照「一輩子的 factor 補充治療」。
Exam Focus 考點
| Item | 中文邏輯 |
|---|---|
| Human genome size | ~3 Gb |
| Protein-coding genes | ~20,000 |
| Coding genome | ~50 Mb（約佔 1.6%） |
| HGP cost | $3 billion（Nature 2001） |
| HTT repeats | <27 normal／40+ disease |
| CNV statistic | Log2 ratio = normalized read depth, case over control |
| TP53 vs KRAS | Tumour suppressor, loss of function ↔ Oncogene, gain of function |
| 三個 variant 來源 | germline／somatic／de novo |
| WGS vs WES vs targeted | 全部 ↔ 只有 exon ↔ 先 enrichment 的指定區域 |
| 短讀長 vs 長讀長 assembler | SOAPdenovo／SPADES／MEGAHIT ↔ Flye／canu |
| Alignment tools | BWA／BOWTIE2／MINIMAP2 |
If you only remember one thing 只記一件事
Genomics 就是三問 —— read／understand／edit。Deck 裡每一個工具、格式、引用都屬於其中一問。
題目看不懂時，先問它屬於哪一問。
題目看不懂時，先問它屬於哪一問。
完整性註記：本講共 78 張內容頁，其中相當數量為圖／截圖頁，無法抽取文字（測序峰圖、IGV 截圖、CNV 圖、pathway 圖、測序成本曲線）。上列所有引用、工具名稱與數字均照講義原文，可據此回溯那些圖片。
Detail Pass 深入補充 —— 投影片完整表格與圖示
投影片的完整表格與圖示——深入層。
這一講圖特別多：79 頁裡相當大一部分的內容只存在於圖表，不在正文。以下是把投影片當「頁面」看（而不只是抽文字）才拿得到的材料 —— 其中一張表對做測序的人來說是整堂的核心。
Sequencing Platforms 完整比較表
完整平台比較表：每個平台的讀長與錯誤型態。
講義把所有主要平台分成三代，用七個維度對比。這是整堂課的參考表。
| Technology | 平均讀長 | 運行時間 | 優點 | 缺點 | 錯誤類型 | Year |
|---|---|---|---|---|---|---|
| First generation | ||||||
| Sanger | ~1000 | ~2 小時 | 單一讀長長 | 最早的測序技術，成本高 | Insertion／deletion／substitution | 1977 |
| Second generation | ||||||
| Roche 454 | 700 | 24 小時 | 讀長長 | 錯誤率高、運行成本貴 | Insertion／deletion | 2005 |
| Illumina／Solexa | 2 ×（36–100）paired-end | 6 日（rapid mode 2 日） | 成本低、錯誤率低 | 運行時間長 | Substitution | 2006 |
| AB SOLiD | 85 | 8 日 | 每鹼基成本低、錯誤率低 | 運行時間極長 | Substitution | 2007 |
| Helicos Biosciences | 55 | 視讀長而定 | 錯誤率低 | 運行時間長 | Insertion／deletion | 2009 |
| Ion Torrent | 400 | 2 小時 | 運行時間短、設備較便宜 | 錯誤率高 | Insertion／deletion | 2010 |
| Third generation | ||||||
| Pacific Biosciences | 3000（最高 15000） | 20 分鐘–4 小時 | 讀長最長、運行快 | 錯誤率高 | Insertion／deletion | 2010 |
| Oxford Nanopore（MinION） | 9545 | < 6 小時 | 讀長長；小型低成本 USB 裝置 | 錯誤率高 | Insertion／deletion／substitution | 2014 |
Exam focus —— 表裡的規律
把這張表讀成一個取捨故事，因為考題一定問取捨，不會問單一格：
讀長：1000（Sanger）→ 55–700（二代）→ 3000–9545（三代）
運行時間：2 小時 → 8 日 → 6 小時以內
錯誤類型是分族的關鍵 → 只有 Illumina/Solexa 與 AB SOLiD 是 substitution error，其餘全部平台都是 insertion–deletion error；Sanger 與 Oxford Nanopore 三種都有
成本是二代的優勢 → 「低錯誤率 + 低成本」就是短讀長贏得市場的原因
讀長：1000（Sanger）→ 55–700（二代）→ 3000–9545（三代）
運行時間：2 小時 → 8 日 → 6 小時以內
錯誤類型是分族的關鍵 → 只有 Illumina/Solexa 與 AB SOLiD 是 substitution error，其餘全部平台都是 insertion–deletion error；Sanger 與 Oxford Nanopore 三種都有
成本是二代的優勢 → 「低錯誤率 + 低成本」就是短讀長贏得市場的原因
BGI 在這張表的位置
講義沒有把 BGI 放進行裡 —— 它把兩個標籤放在表旁邊：BGI DNB-Seq 貼著「second generation」區塊，BGI Cyclone-seq 貼著「third generation」區塊。
讀版面就讀到訊息：DNB-Seq 被定位為短讀長二代技術；Cyclone-seq 被定位為長讀長三代技術。這個「代」的定位就是這頁要講的事。
讀版面就讀到訊息：DNB-Seq 被定位為短讀長二代技術；Cyclone-seq 被定位為長讀長三代技術。這個「代」的定位就是這頁要講的事。
Platform Choice 五個練習情境
五個練習情境：按問題選平台，看讀長與準確度。
講義接著出一張工作表：每個項目要你講出建議用哪些平台以及為什麼。這是課堂討論題，也是五個情境。
| Project | 中文邏輯（這題真正在考什麼） |
|---|---|
| De novo sequencing and assembly of a microbial genome | 基因組小、無參考 → 必須 assembly；長讀長解重複序列 |
| Sequencing a plasmid | 極小、骨架已知 → 最便宜且足夠的方法就贏 |
| Re-sequencing a human genome（如癌症樣本）找 novel mutations | 基因組大、有參考、低頻變異重要 → 深度與準確度優先於讀長 |
| Rapid diagnosis of a viral infection 在野外測序 | 速度與可攜性主導 → 運行時間與儀器體積決定 |
| Targeted amplicon／exome sequencing | 區域已定義 → 先 enrichment，再在小範圍上做高深度 |
講義給的答案
工作表之後，講義直接給結論：
「In reality, one sequencing project may combine multiple sequencing techniques.」
所以正確答案永遠不是單一平台，而是用哪個組合、每一部分負責什麼。
「In reality, one sequencing project may combine multiple sequencing techniques.」
所以正確答案永遠不是單一平台，而是用哪個組合、每一部分負責什麼。
Variant Detection Methods 工具矩陣
工具矩陣：方法家族 × germline／somatic，一張表記住。
Variant calling 同時按兩件事分類：統計方法家族，以及變異來源。講義給出每一格的工具名。
| Method family | Germline mutations | Somatic mutations |
|---|---|---|
| Heuristic | — | Varscan |
| Statistical methods | GATK-HaplotypeCaller／Samtools／FreeBayes／Platypus／Octopus | Scomatic／Mutect2／Octopus／Vardict |
| Deep learning methods | DeepVariant／Strelka2 | Strelka2 |
| Graph models | Dragen／Pangenie | — |
Exam focus —— 兩件要注意的事
① 這張表不對稱。只有兩個工具兩邊都出現（Octopus 與 Strelka2），而 heuristic 那行的 germline 是空的、graph model 那行的 somatic 是空的。→ germline 與 somatic calling 是兩個不同的問題，所以工具清單不同。
② 四個家族是歷史層積。heuristic → statistical → deep learning → graph models 大致就是這個領域的演進順序。另注意 graph model 那格的 DRAGEN 正是 Illumina 儀器內建的生資引擎 → 提醒你「用哪個 caller」有一部分是「用哪台機器」決定的。
② 四個家族是歷史層積。heuristic → statistical → deep learning → graph models 大致就是這個領域的演進順序。另注意 graph model 那格的 DRAGEN 正是 Illumina 儀器內建的生資引擎 → 提醒你「用哪個 caller」有一部分是「用哪台機器」決定的。
Coding Mutations 完整分類
編碼突變完整分類：synonymous／missense／nonsense／frameshift，後果各異。
這頁有完整示範，用一個 codon 定義出四種結果。原始序列 5'-AAG-3'／3'-TTC-5' → 轉錄成 mRNA 5'-AAG-3' → 轉譯成 Lys：
| Mutated DNA | Mutated mRNA | 蛋白結果 | 分類 |
|---|---|---|---|
| AAA | AAA | Lys（不變） | Synonymous／silent |
| TAG | UAG | STOP | Nonsense（屬 non-synonymous） |
| AGG | AGG | Arg | Non-synonymous → missense |
| ACG | ACG | Thr | Non-synonymous → missense |
講義把它畫成階層，這是最容易記的形態：
| Category | 包含 |
|---|---|
| Synonymous／silent | codon 變了，但胺基酸沒變 |
| Non-synonymous | → Nonsense（造出提前的 STOP，截斷蛋白） → Missense（換成另一個胺基酸） |
Indel 是另一套機制 —— 兩者要分開
講義用獨立一塊處理，標題是 「Indels are often frameshifting」。圖示：正常序列讀成三個 codon（
Substitution 只改一個 codon；indel 改掉下游每一個 codon。這就是為什麼插入一個鹼基的後果，通常比替換一個鹼基嚴重。
ATG CAT TGC），然後插入一個 T → 標註寫 「Reading frame has been changed」。Substitution 只改一個 codon；indel 改掉下游每一個 codon。這就是為什麼插入一個鹼基的後果，通常比替換一個鹼基嚴重。
前一面投影片，講義把 central dogma（DNA → transcription → RNA → translation → protein）配上完整遺傳密碼表，並標出 start 與 stop codon —— 就是讀上面那張表所需要的參考。
Genomic Variation 完整分類
基因組變異完整分類：SNV、indel、CNV、fusion＋染色體層事件。
講義的變異頁分兩個層級。把層級分清楚很重要，因為考題通常一次只考一層。
| Level | Types |
|---|---|
| Sequence level（講義把這三個圈在一起，標為 "mutations"） | Insertion／SNP／Deletion |
| （畫在同一條序列上） | Tandem repeats → 講義示例是 CAG 重複 |
| Chromosome level（七種，各有圖示） | Aneuploidy／Deletion／Insertion／Duplication／Inversion／Translocation／Extrachromosomal DNA |
最常被漏掉的那一個
Extrachromosomal DNA 是第七種染色體層級變異，也最容易被漏 —— 圖示畫成染色體外的小型環狀 DNA 元件。
另注意 deletion 與 insertion 兩個層級都出現：同一個詞，既指鹼基層級的改變，也指染色體片段的改變。答題前先看它問哪一層。
另注意 deletion 與 insertion 兩個層級都出現：同一個詞，既指鹼基層級的改變，也指染色體片段的改變。答題前先看它問哪一層。
Gene Fusions 歷史地圖（1914–2014）
融合歷史地圖：1914 Boveri → 1960 費城染色體 → 2014。
講義不是列表，是把 fusion 鋪在一條百年時間軸上，並用顏色標組織類型 —— 紫色 = haematological、綠色 = soft tissue。顏色編碼本身就是發現：同一套機制在不同組織反覆出現。
| Era | 中文邏輯 |
|---|---|
| 1914 —— 概念 | Boveri，mitotic aberrations |
| 1960 —— 奠基觀察 | Philadelphia chromosome（CML） |
| 1960s–70s —— 細胞遺傳學 | t(9;22) CML／t(8;21) CML／t(15;17) APL／t(8;14) Burkitt's lymphoma |
| 1980s–90s —— 分子選殖 | t(11;22) Ewing's sarcoma／BCR-ABL1 CML／PAX3-FKHR alveolar rhabdomyosarcoma／AML1-X AML／ATF-EWS clear cell sarcoma／FUS-ERG AML／PML-RARA APL／CHOP-FUS liposarcoma |
| 2000s–2014 —— 系統性發現 | MLL-X MLL／FLI1-EWS Ewing's sarcoma／ETV6-NTRK3 Ph-like ALL／ERG-EWS Ewing's sarcoma／SYT-SSX synovial sarcoma／NPM-ALK anaplastic lymphoma／PDGFb-TEL CML／NAB2-STAT6 solitary fibrous tumour |
Exam focus
三個 fusion 名字權重最高，因為各自綁著一個藥或一個診斷：BCR-ABL1（CML → Imatinib）、PML-RARA（APL）、ETV6-NTRK3（Ph-like ALL → NTRK 抑制劑那條線）。只記三個就記這三個。
另注意走向：1914 年還只是關於 mitotic error 的假說；到 2014 年 fusion 已經被系統性發現並對上藥物。
另注意走向：1914 年還只是關於 mitotic error 的假說；到 2014 年 fusion 已經被系統性發現並對上藥物。
CNV 臨床應用 —— Down syndrome 作為示範
CNV 臨床：NIPT——Lo et al. 在母血漿找到胎兒游離 DNA → 唐氏篩查。
講義在 CNV 段回答自己開場那一問（「How can we diagnose Down syndrome?」），答案本身就是一個 copy-number 改變：
- Trisomy 21 → karyotype 顯示第 21 號染色體有三條（而非兩條）。這就是它的全部分子定義
- 講義把 karyotype 配上臨床特徵面板 → 鼻／口／耳細小；杏仁形眼、內眼角有皮膚褶；眼球有色部分有白斑；臉圓而平；第五指略彎；身型矮壯
- 另帶一句值得記住的提醒 → 智能障礙與發展遲緩的程度因人而異
為什麼這個例子是整堂課的鉸鏈
Down syndrome 把 deck 的三個部分串起來 → 它是 CNV（aneuploidy）；它是 NIPT 篩查的標的（而 NIPT 是建立在前面引用的 Lo et al. cell-free DNA 工作上）；它也是為什麼 read-depth 量測（Log2 ratio）會是一項臨床級技術而不是研究趣味。
一個例子，串三個章節。
一個例子，串三個章節。
方法註記：上列表格是把投影片渲染成圖再讀出來的，因為這份 deck 有相當大比例的内容只存在於圖表。凡圖上清晰可讀的格子都照原文重現；原稿明顯的錯字（例如廠商名拼錯、"expansive" 應為 "expensive"）已直接改正，以免複習時記錯。
T2T-CHM13 —— 為什麼人類參考基因體到 2022 年才算完成
人類基因體計畫的草圖（2001）其實從未完成：約 8% 的基因體 —— 著絲粒、端粒以及其他長重複序列 —— 用短讀長組裝不出來。T2T-CHM13（2022）是第一個真正無縫、端粒到端粒的人類參考基因體。
| 參考版本 | 年份 | 狀態 |
|---|---|---|
| HG19／GRCh37 | 2009 | 長期主力版本；約 8% 基因體缺失或被壓縮摺疊。 |
| HG38／GRCh38 | 2013 | 已改善，但重複區域仍有缺口與假性重複。 |
| T2T-CHM13 | 2022 | 第一個完整無縫組裝 —— 著絲粒、端粒與區段重複都已解開。需要長讀長（PacBio HiFi／Nanopore）才做得到。 |
為什麼這件事有臨床與商業意義：缺失的那 8% 不是垃圾 —— 它富集在區段重複與重複序列，而結構變異正好住在那裡，若干疾病相關變異也正好落在那裡。短讀長重定序看不見它們。
基因結構 —— 排列順序，以及兩端不轉譯區各自管什麼
一個基因由左至右讀作 啟動子 → 5′ UTR → 外顯子 → 內含子 → 外顯子 → 3′ UTR。兩段 UTR 會被轉錄但不會被轉譯，而且各做不同的事：5′ 管轉譯效率，3′ 管訊息能活多久。
| 區域 | 會被轉譯？ | 功能 |
|---|---|---|
| 啟動子 | 不會（連轉錄都沒有） | RNA 聚合酶與轉錄因子的結合位；決定要不要轉錄、轉錄多少。 |
| 5′ UTR | 不會 | 控制轉譯效率 —— 核糖體在此裝載並掃描。此處的二級結構或上游 ORF 會壓低蛋白質產量。 |
| 外顯子 | 會 | 剪接後保留在成熟 mRNA 中的編碼序列。 |
| 內含子 | 不會（被剪掉） | 由剪接體移除；剪接位突變破壞的正是這些邊界。 |
| 3′ UTR | 不會 | 控制 mRNA 穩定性與壽命 —— 此處的 AU-rich 元件與 miRNA 結合位決定降解速率，因而決定同一條轉錄本能產出多少蛋白質。 |
為什麼這會出現在藥物設計裡：mRNA 半衰期是一個可設計的變數，而 3′ UTR 是其中一個旋鈕。它也解釋了為什麼 mRNA 量與蛋白質量相關性很差（L6 那個數字，r ≈ 0.4）：兩條轉錄本數量相同的基因，可以因為 UTR 設定了不同的轉譯效率與降解速率，而產出相差甚遠的蛋白質量。
三類變異 —— 生殖系、新發、體細胞
這個區分決定的是遺傳性與該驗誰：生殖系在卵或精子裡、可遺傳；新發是小孩身上新出現、父母都沒有；體細胞是身體組織後天獲得、完全不傳給下一代。
| 類別 | 在哪裡產生 | 會遺傳？ | 典型判讀 |
|---|---|---|---|
| 生殖系 | 配子；小孩全身每個細胞都有 | 會 | 家族性疾病、帶因篩檢、親屬預測性檢測。 |
| 新發 | 早期胚胎或配子形成時 | 對這個小孩會，但父母檢測為陰性 | 解釋「沒有家族史卻患病」—— 許多嚴重顯性發育疾病的關鍵。 |
| 體細胞 | 單一身體細胞，然後是它的子代細胞 | 不會 | 癌症。腫瘤裡有、血液裡沒有 —— 所以要做腫瘤－正常配對定序。 |
實驗上的結果：生殖系與新發變異在血液或唾液裡就找得到；體細胞腫瘤變異必須取腫瘤組織（或 ctDNA）。把腫瘤與病人自己的生殖系做比對，正是區分驅動變異與無害遺傳多型性的方法。
參考資料庫 —— 哪一個回答哪一種問題
四個名字幾乎涵蓋所有查詢工作：NCBI 查序列與文獻，UniProt 查蛋白質序列與功能註解，KEGG 與 GO 查通路與功能詞彙，BLAST／DIAMOND 做相似度搜尋。
| 資源 | 內容 | 什麼時候該用它 |
|---|---|---|
| NCBI | GenBank 序列、RefSeq、PubMed | 要一段核苷酸或蛋白質序列，或它背後的那篇論文。 |
| UniProt | 蛋白質序列 ＋ 經人工校訂的功能、結構域、PTM | 「這個蛋白質做什麼／在哪裡／被什麼修飾？」—— 蛋白質體學這一側對照 NCBI 的資源。 |
| GO（基因本體） | 受控詞彙：分子功能、生物程序、細胞組成分 | 把一串基因轉成功能主題（富集分析）。 |
| KEGG | 經人工校訂的通路與網絡圖 | 「這組基因位在哪條通路？」 |
| BLAST／DIAMOND | 相似度搜尋（DIAMOND 較快，適合大量資料） | 手上有一段未知序列 —— 找它的同源物並推論功能。 |
這些都不取代前面讀過的比對與定量工具；它們是你拿到結果之後才去查的註解層。
TBXT 與 AluY 嵌入 —— 人為什麼沒有尾巴
2024 年 Nature 的結果：一個 AluY 元件嵌入 TBXT 基因的內含子，導致剪接時跳過外顯子 6，產生較短的 TBXT 異構體 —— 而正是這個替代剪接在靈長類譜系中抑制了尾巴的形成。
為什麼它是好的考試例子：它是一個非編碼變動卻造成巨大表型效應，作用是透過剪接而非改變蛋白質序列本身，而且它證明 Alu 移動元件真的在做演化上的工作，不是「垃圾 DNA」。
它也呼應筆記裡已經出現過的治療概念：若一個疾病是因外顯子跳躍而起，那麼強迫或阻斷那次跳躍就是一種藥物策略 —— 這正是反義寡核苷酸用於剪接調節療法的同一套邏輯。
如何計算定序深度（講義給原料，公式屬推導）
先講清楚來源
這份 79 頁 deck 沒有一張「depth 公式」的獨立投影片。相關原料散在四頁：p4（人類基因組 3 Gb）、p11（Illumina 讀長 2×150）、p34（3 Gb 基因組／50 Mb 編碼區）、p37（WGS／WES／targeted 的覆蓋示意）。以下公式是把這些數字接起來的推導，不是講義原文。
定義與公式
Depth（定序深度）＝平均每個鹼基被讀到幾次。
Depth = (read 數 × 讀長) ÷ 目標大小；反過來，需要的資料量 = Depth × 目標大小。
| 符號 | 意思 | 例 |
|---|---|---|
| N | reads（或 read pairs）數目 | 300 M pairs |
| L | 每條 read 的長度 | PE150 → 每對 300 bp |
| G | 目標大小（基因組／外顯子／panel） | 3 Gb、50 Mb、1 Mb |
三個算例（考試最常考這種）
| 情境 | 計算 | 答案 |
|---|---|---|
| 人類 WGS 30× | 30 × 3 Gb = 90 Gb；90 Gb ÷ 300 bp = 300 M | 約 3 億對 PE150 reads |
| WES 100×（外顯子 50 Mb） | 100 × 50 Mb = 5 Gb；5 Gb ÷ 300 bp ≈ 16.7 M | 約 1,670 萬對 |
| Panel 500×（1 Mb） | 500 × 1 Mb = 0.5 Gb；0.5 Gb ÷ 300 bp ≈ 1.67 M | 約 167 萬對 |
快速換算
1 Gb ÷ 300 bp ≈ 3.3 M 對 PE150 reads。所以「30× 人類 WGS」＝ 90 Gb ≈ 300 M pairs；「100× WES」＝ 5 Gb ≈ 17 M pairs。
常見陷阱
| 陷阱 | 正確理解 |
|---|---|
| 把 depth 與 breadth／coverage 當同一件事 | depth 是平均次數；breadth 是有多少比例的被鹼基至少被讀到一次（30× 平均也可能有 5% 鹼基是 0×） |
| 忘記 on-target rate | WES 捕獲效率通常 60–80%，所以實際要多送 25–60% 資料才達到標稱深度 |
| 忽略 duplicate rate | PCR 重複會佔掉有效深度；定序越深，duplicate 比例通常越高 |
| 用 read 數直接比較不同讀長平台 | 要換成 total bases 才能比較；300 bp × 100 M = 30 Gb，與 150 bp × 200 M 相同 |
各應用的慣用深度（背起來）
| 應用 | 典型深度 | 原因 |
|---|---|---|
| 人類 WGS（germline） | 30× | 雜合變異呼叫的平衡點 |
| WES | 100× | 目標小、需要更高深度補捕獲損失 |
| Cancer panel | 500–1,000× | 腫瘤異質性、低頻突變（VAF 5%） |
| RNA-seq（bulk） | 20–30 M reads／樣本 | 轉錄本定量足夠 |
| 單細胞 RNA-seq | 2–5 萬 reads／細胞 | 單細胞基因數有限 |
三問——讀、懂、改；按讀長與錯誤型態選平台；基因融合是最乾淨的靶。