ABCT 101 · 第五講 · Transcriptomics

📚 第五講 · Transcriptomics Prof. Quanhua Mu · 2026-09-30

同一個基因組，不同的演奏。轉錄組是「會變」的那一層——而定量的關鍵在於先除哪一個。

101 · L5 Transcriptomics 轉錄組學 — 由 reads 到單細胞

第五講 · Transcriptomics（Prof. Quanhua Mu）

ABCT5101 第五講，由 Prof. Quanhua Mu 主講 —— 即課程的 bioinformatics 部分。 如果 L4 是「讀基因組」，這講就是「量度基因組實際上正在做什麼」。本講屬 10 月 14 日期中考範圍 （期中考覆蓋 L1–L6），而且是整個 deck 最新的材料。

Master Logic 主線邏輯 —— 轉錄組是「會變」的那一層

  • 基因組在每個細胞基本一樣 → 解釋不到肝細胞與神經元之差異
  • 轉錄組隨細胞類型、組織、時間而變 → 所以既是生物學重點，亦是商業切入點
  • 全講一條線：有什麼 RNA → 如何量測 → 如何定量 → 如何比較 → 如何找模式 → 如何做到單細胞
層分子-omics 名稱
DNA →（transcription）GenomeGenomics
RNA →（translation）TranscriptomeTranscriptomics
ProteinProteomeProteomics

人類基因組約 20,000 個基因；轉錄組就是「哪幾個正在轉錄、量多少」。

1 · Key Terms —— RNA 類別與大小

RNA 類別與大小：microRNA ~21 nt 最短；tRNA 74–95；mRNA kb；lncRNA 最長（2.2–17 kb）。

大小不是裝飾，它預測功能。

類別大小功能
mRNA（coding）kb 級攜帶密碼。結構：5′cap、5′UTR、open reading frame、exon／intron、Poly-A tail
microRNA~21 nt經 DICER 加工，結合 mRNA 以阻止翻譯或引發降解
piRNA29–30 nt生殖系相關小 RNA
tRNA74–95 nt物理適配器；需摺疊 → 所以要有足夠長度（acceptor stem、TψC loop、D-loop、variable loop、anticodon loop）
snRNA／snoRNA／sbRNA中等剪接同 RNA 加工機器
lncRNA約 2.2 kb–17 kb支架／調控。例：HOTAIR 招募 PRC2 同 LSD1，經組蛋白甲基化（H3K27me）沉默轉移抑制基因
2024 諾貝爾獎 非編碼 RNA 一頁引用 nobelprize.org/prizes/medicine/2024（microRNA 發現）—— 考試問「為何 ncRNA 重要」，這個就是講者自己的框架。

2 · 量度轉錄組 —— 豐度決定方法

rRNA 佔大多數；poly(A) 富集快但漏非 polyA，rRNA depletion 更全面。

  • 先要知道管裡面有什麼：deck 對比 RNA by mass 與 RNA by number of molecules
  • 以分子數計，rRNA 佔壓倒性多數 → 所以定序總 RNA 會將大部分 reads 花在核糖體序列
策略做法得失
PolyA enrichment變性 → 以 oligo-dT 雜交 poly(A) 尾 → 洗脫便宜有效、聚焦 mRNA；漏掉非 polyA 轉錄本同降解 RNA
rRNA depletion針對性移除 18S／28S rRNA → 片段化保留非 polyA（許多 lncRNA、FFPE／降解樣本）；成本較高、需更多起始量

三種量度技術，按歷史次序：

技術原理限制
MicroarraycDNA 螢光標記 → 雜交到陣列；螢光代表結合，結合代表有表達只偵測陣列上有的序列 → 無法發現新轉錄本
RNA-seq片段化 → 反轉錄成 ds-cDNA → 高通量定序 → 比對參考需組裝或比對；read 長度限制可解析度
Nanopore（長讀）DNA／RNA 穿過膜上的 motor protein 同 reader protein；ionic current 變化由 basecalling 解讀逐鹼基準確度較低，但全長 reads 給出完整 isoform 圖譜 —— 課堂用語是 “No assembly required”

3 · 由 reads 到數字 — 比對同定量

剪接感知比對（STAR、HISAT2）；沒有參考基因組時用 Trinity。

  • Splice-aware aligners are needed：成熟 mRNA 已剪去內含子 → 跨 exon–exon 交界的 read 在轉錄本中相連、在基因組中相隔幾千鹼基
  • 所以要將單一 read 切成多段；代表工具 STAR（另有 HISAT2、BOWTIE2、Kallisto）
  • 組裝兩條路線：參考引導（TopHat + Cufflinks）或 de novo（Trinity）

3a · 為何 raw read 數不可直接比較

兩個效應——基因長度＋定序深度——令 raw count 不可以直接比較。

假設一個樣本得出以下三個基因的計數，此時完全未做任何標準化：

基因長度比對到的 reads樣本總 mapped reads
A2,000 bp = 2.0 kb240,0003,000,000
B600 bp = 0.6 kb100,000
C3,000 bp = 3.0 kb64

基因 A 看似比 B 「大」2.4 倍，但這個印象錯了兩次：

陷阱為何 raw 計數會講大話
長度A 長 2.0 kb、B 只 0.6 kb。同一表達水平下，轉錄本越長就自然收集越多 reads —— 就像越長的街道會掉到越多垃圾。不修正就等了「每次比較都變成在量長度」。
定序深度同一個庫跑雙倍深度，每個基因的計數都會雙倍。這個數字反映的是「你定序了多少」，不是「細胞表達了多少」。

所以要做兩個修正。問題只得一個：哪一個做先？ —— 問題就在這度，RPKM/FPKM 同 TPM 的差別完全就是這個次序。

3b · RPKM 同 FPKM — 先處理長度

RPKM／FPKM：先除長度、再除總 reads；各樣本總和不固定。

Reads Per Kilobase per Million mapped reads。兩步，次序如下：

  1. 把計數除以該基因長度（以 kb 計）→ 消除長度優勢
  2. 再除以 （總 mapped reads ÷ 1,000,000） → 消除深度優勢
基因步驟 1：reads ÷ 長度 (kb)步驟 2：÷ 3.0RPKM
A240,000 ÷ 2.0 = 120,000120,000 ÷ 3.040,000
B100,000 ÷ 0.6 = 166,667166,667 ÷ 3.055,556
C64 ÷ 3.0 = 21.321.3 ÷ 3.07.1

排名翻轉了。用 raw reads 看，A 贏 B 2.4 倍；用 RPKM 看， B 反而贏 A。Raw 計數把方向弄反了，而這個「翻轉」就是這個指標存在的全部意義。

FPKM 是雙端（paired-end）版本：兩條 mate 來自同一個物理 fragment，所以要數 fragments 而不數 reads。在單端資料上，RPKM 同 FPKM 數值完全相同。

3c · TPM — 先處理深度

TPM：先除長度、再換算到固定一百萬——跨樣本可比。

Transcripts Per Million。同樣兩個修正，但次序相反：

  1. 先把每個計數除以自己的長度（kb）
  2. 把這些「長度修正後」的值全部加起來，再把每個表示為佔總和的佔比 × 1,000,000
基因步驟 1：reads ÷ 長度 (kb)步驟 2：佔 286,688 的佔比 × 106TPM
A120,000120,000 ÷ 286,688418,574
B166,667166,667 ÷ 286,688581,352
C21.321.3 ÷ 286,68874
總和1,000,000

注意 TPM 沒有改變的事：B 仍然贏 A。在同一個樣本內，兩個指標的排名一樣， 因為兩者做的是同一兩個修正。差別只在「數字代表啦」。

3d · 唯一真正重要的差別

次序決定一切：TPM 總和 = 1,000,000；RPKM／FPKM 不會。

RPKM / FPKMTPM
分母樣本總 mapped reads長度修正值的總和
值會否總和為定數？不會 — 例子中它們加起來是 95,563，一個沒有意義、會隨樣本組成漂移的數字會 — 永遠剛好 1,000,000
它到底答緧啦問題「我收集到的 reads 當中，有多少是來自這個基因？」「這個基因佔這個樣本總表達量的多少？」
跨樣本比較不穩：假如樣本 2 剛好被幾個極高表達基因主孰，其他基因的 RPKM 會被壓低 —— 而原因同該基因本身無關穩定：每個基因是固定總數的一份佔比，組成變化會顯現而不會被掩藏
10 秒版本 RPKM/FPKM 是「每收集到一百萬個 reads」；TPM 是「每一百萬個之中、你佔多少」。 「佔總數的每百萬」是會移動的尺，因為總數取決於其他基因有幾表達；「佔大家的每百萬」是固定的尺。
本課程要記住的分界線：長度同深度是兩個不同的干擾，而 RPKM/FPKM 對 TPM 完全只是「移除他們的次序」。

3e · log2 fold change — 為何有個「2」

log2FC 裡的「2」：2 即是 4 倍；log 令上調與下調對稱。

Fold change 就是一個比例：條件 2 的表達除以條件 1。加「log2」 唯一目的是讓數字變得對稱。

變化比例比例的 log2怎麼讀
上調 8 倍8+3幅度相等、符號相反 —— 兩個變化是鏡像
下調 8 倍1/8 = 0.125−3
不變10零代表無變化，所以軸有自然中心

在普通比例尺度上，「上調 8 倍」是 8、「下調 8 倍」是 0.125 —— 不對稱，也無法合理地取平均。所以 log2 把乘法變成加法： +3 不論上定下都是同一個幅度，而「雙倍再雙倍」就是 +1 +1 = +2。 Volcano plot 上你讀到的每個 fold change 都是這個尺度。

個「2」不是兩個意思 它不是任何計數，也不是 p 值。log2FC = 3 代表變了 8 倍； 至於「是否顯著」是另一個問題，由 y 軸回答。

3f · 為何説表達量是 log-normal

表達是乘法過程 → log-normal；取 log 之後先做得到統計。

拿一個樣本，把每個基因的表達值畫出來。原始值檢极偏斜： 少數基因在極高位，大部分基因擠在底部，所以線性軸的直方圖是一根高尖峰加一條長尾，難讀亦難推理。

現在取對數再畫。同一批資料變成近乎對稱、鑽鑑形。這就是 「log-normal」的意思：這些值本身取對數後就跟從正態分佈 —— 一個被取次方後的正態形狀。

後果為何如此
畫圖同分群要用 log 尺度否則單一個極高表達基因會主孰任何距離或顏色尺度，其他基因全部變得平坦
應用幾何平均，不用算術平均log-normal 下算術平均會被尾巴拖高，描述不到任何典型基因 —— 1 同 100 的算術平均是 50.5，但幾何平均是 10
少數基因拿走大部分 reads這正正就是為何 TPM 「佔固定總數的一份」更穩定 —— 3d 節就是同一個事實從另一點看
不好過度延伸 「log-normal」描述的是表達值的形狀。它不代表你可以拿 log 值去做差異表達檢定。 DESeq2 是對 raw counts 建模，用 negative binomial 分佈，內部自行轉換 —— log-normal 這個觀察是用來畫圖、摘要同檢查，不是拿 log TPM 去跑 t-test 的許可證。
若果這節會考，四個答案
  1. 點名兩個干擾：轉錄本長度同定序深度
  2. 講出唯一真正差別：RPKM/FPKM 先長度後深度；TPM 先深度後長度， 所以 TPM 總和為 1,000,000，RPKM/FPKM 不會
  3. 説清數字意義：RPKM/FPKM = 你收集到 reads 的佔比；TPM = 樣本表達量的佔比
  4. 解釋 log2：令上調下調對零對稱，把乘法變加法；未取對數的比例不對稱、也無法有意義地取平均

4 · 比較條件 —— differential expression

差異表達：DESeq2 建模；volcano plot＝效應 vs 顯著性；多重檢定要校正（FDR）。

  • 標準工具 DESeq2；結果看 volcano plot：x 軸 log2 fold change、y 軸 −log10 p-value
  • 因為一次檢驗數千個基因，raw p-value 會產生假陽性 → 必須做 multiple-testing correction
課堂自己標出的兩個陷阱 Pseudocount：log2FC 以一組除另一組，某基因在一組為零就破壞算式 → 取對數前加偽計數。
p 值可以顯示為 0：若真值低於工具數值精度會印成 0 —— 是格式假象，不是無限顯著。
校正方法方向
Bonferroni最嚴 —— 最多假陰性
Bonferroni step-down逐步放寬
Westfall and Young permutation重抽樣為本
Benjamini and Hochberg FDR常用折衷
None最寬鬆 —— 最多假陽性

5 · 找模式 —— GSEA、分群、網絡

GSEA 考的是通路而非單基因；leading edge 是推動分數的那群基因。

  • GSEA：問「一組基因是否協同位移」，而非逐個基因檢驗。基因按與表型的相關性排序，沿排序做 random walk，得出 enrichment score ES(S)；距零最大偏差就是分數，leading edge subset 是驅動該分數的子集。基因集來自 MSigDB（H、C1–C7，含 CGP、CP）
  • 分群同降維：先 PCA（PC1 捕捉最大變異，然後 PC2、PC3），再用非線性方法；例子是 medulloblastoma 分型
  • Co-expression：把相關（如 r = 0.7）的基因分成模組（ME1–ME6）
  • 轉錄調控網絡：連接轉錄因子（CEBP、STAT3、BHLHE40、FOSL2、RUNX1）與其目標 —— 課堂圖上有一個 “Target?” 箭頭，因為「目標是哪一個」正是未解問題
  • Deconvolution：CIBERSORT／CIBERSORTx 從 bulk 樣本推估細胞類型組成 —— 這個就是通往單細胞的橋樑：如果答案是「組成」，bulk 本身不夠
  • 選擇性剪接：同一批 RNA-seq 數據揭示剪接模式，可產生基因組單獨無法預測的 peptide–MHC 新抗原
  • 整合分析：WES＋RNA-Seq（FPKM ≥ 1）→ NetMHCpan → 候選 neoantigen。Genomics 提供突變；transcriptomics 提供「確實有表達」的證據

6 · 非編碼 RNA 作為產品

非編碼 RNA 作為產品——2024 Nobel 頒給 microRNA。

類別機制／例子
lncRNAHOTAIR（PRC2／LSD1 → H3K27me）；BACE1-AS；HULC（吸附 miR-372）；NEAT1（paraspeckles）；NRON（NFAT）。商業興趣見於課堂引用的 NextRNA 循環
microRNA 藥物整張開發表：MRX34（miR-34a）、TargomiR（miR-16）、MRG-106 Cobomarsen（miR-155）、INT-1B3、TTX-MC138、RGLS5579 —— 各有期別、NCT 編號同癌種
環狀 RNA由 back-splicing 形成（例：circFOXO3，染色體 6q21）。被用作為穩定 RNA 格式：課堂展示 RXRG001，一條編碼 hAQP1 的環狀 mRNA，用於 xerostomia
已批准 RNA 藥物26 行已上市產品表 —— Alnylam siRNA、Ionis ASO、aptamer、mRNA 疫苗、Sarepta DMD ASO。ASO ＝ antisense oligonucleotide

7 · 單細胞 RNA 定序

單細胞：每細胞一個 barcode、每分子一個 UMI；drop-out 是主要假象。

  • 為何要單細胞？ Bulk 對數百萬細胞取平均 → 罕見亞群會消失於平均值中；單細胞把平均值拆解為組成部分
  • 平台：Smart-Seq、Drop-Seq、10X Genomics、Bio-Rad ddSeq、BD Rhapsody、Singleron Matrix、SPLiT-seq、Parse Evercode —— 按吞吐量、靈活性、靈敏度、流程簡便性、公開數據可得性評分，沒有一個平台五項全勝
術語課堂定義
UMI標記每一條 mRNA 分子，令擴增噪聲同偏差可藉「數分子而不數 reads」移除。次序重要：先貼標籤、後擴增、按標籤去重
Drop-out某基因在一個細胞呈中高表現，但在另一個細胞完全測不到。成因：技術假象、統計抽樣、生物因素

因為每細胞捕獲量極少，「零」是有歧義 —— 證據缺席不等於缺席證據。三種回應按「假設走多少」排序：

  1. 忽略零膨脹 —— 假設多數零是真生物學
  2. 降維 —— 最廣泛使用；繞過零而不逐基因填補
  3. 填補 —— 例如 MAGIC（van Dijk et al, Cell 2018），沿細胞相似圖平滑；強大但會創造數值，可能製造原本不存在的結構

分析流程：降維 → 分群 → marker 基因 → 細胞類型註釋 → 下游生物學。

步驟課堂點名的方法
降維線性：PCA、ICA。非線性：t-SNE、UMAP、GrandPrix。模型式：ZIFA。深度學習：VAE、scvis、DCA。集成：SIMLR
PCA線性代數方法；PC1 代表最大變異，然後 PC2、PC3。限制：PC 是基因的線性組合，所以 PCA 找不到非線性結構
分群K-means、階層式、圖為本 —— 節點是細胞、邊是兩細胞相似度。社群偵測：Louvain、Leiden
Marker 基因非參數（Wilcoxon rank sum、Student's t-test）；scRNA 專用 MAST（把 cellular detection rate 當共變量）；bulk 方法 DESeq2
註釋marker → 細胞類型表：IL7R → CD4 T；CD14、LYZ → CD14+ 單核球；MS4A1 → B 細胞；CD8A → CD8 T；GNLY＋NKG7 → NK；FCGR3A＋MS4A7 → FCGR3A+ 單核球；FCER1A＋CST3 → 樹突細胞；PPBP → 巨核細胞

單細胞在癌症的發現：腫瘤並非單一均質群體，而是分成 OPC-like、NPC-like、AC-like、MES-like 狀態。

8 · 空間轉錄組 —— 把細胞放回原位

空間轉錄組把位置加回去：成像式 vs 定序式兩派平台。

  • 課堂點出單細胞的核心限制：解離組織會失去每個細胞的空間資訊
  • 空間轉錄組把它還原；小鼠腦例子用 30 基因 panel
  • 平台分野：成像式（IMC、MERSCOPE、Xenium、CosMx）vs 定序式（Slide-seqV2、Stereo-seq、Visium HD）
  • 分析分為 A–G 類；最新工作已屬多組學（Nature 2024）

9 · Clinical / Business Logic

Deconvolution（CIBERSORT）由 bulk 推估細胞組成——通往臨床的橋。

切入點課堂證據
組織限制性靶點Claudin 18.2（胃）同 NY-ESO-1／CTAG1B（cancer/testis antigen，正常限於睪丸）。表達特異性就是治療窗的來源 —— 同 L4 講 gene fusion 同一套論證
表達本身即靶點ERBB2（HER2）跨 TCGA 隊列；課堂圖示 PAAD normal vs PAAD，P = 6.44 × 10−43
新抗原疫苗編碼 NY-ESO-1、Tyrosinase、MAGE-A3、TPTE 的構建（Nature 2020，NCT02410733）—— 轉錄組指出腫瘤實際上表達什麼
RNA 本身是藥26 種已批准 RNA 藥物；siRNA、ASO、aptamer、mRNA、circRNA 開發管線
平台經濟學單細胞同空間平台以吞吐量、靈敏度、流程簡便性作賣點 —— 同 L4 的 WGS／WES／panel 取捨結構一樣

Exam Focus 考點

最可能考的五點
  1. 中心法則對應 —— genomics／transcriptomics／proteomics 對 DNA／RNA／protein
  2. RNA 類別大小 —— miRNA ~21 nt、piRNA 29–30 nt、tRNA 74–95 nt、lncRNA kb 級
  3. 為何要 splice-aware aligner —— read 可跨基因組中不存在的 exon–exon 交界
  4. 為何要標準化 —— reads 數同時取決於長度同深度，兩者是不同干擾；TPM 與 RPKM／FPKM 差在校正次序
  5. Drop-out —— 單細胞的「零」有歧義（技術／統計／生物），所以三種回應按「假設走多少」排序
兩個易失分位 PolyA enrichment vs rRNA depletion —— 前者漏掉非 polyA 轉錄本；後者成本較高但保留它們。
PCA 限制要講得準 —— 不是「PCA 不好」，而是「PC 是線性組合，所以找不到非線性結構」，這個正是 t-SNE 同 UMAP 存在的理由。

Cell barcode 與 UMI —— 兩個標籤做不同的事

單細胞文庫帶有兩種分子標籤，把它們搞混是標準錯誤：cell barcode 回答這段 read 來自哪個細胞；UMI 回答它來自哪一個原始 RNA 分子 —— 而只有 UMI 能消除 PCR 擴增偏差。

標籤回答什麼消除哪種偏差
Cell barcode哪個細胞？——（它是地址，不是校正）。同一個細胞的所有 read 共用；「雙細胞 doublet」就是兩個細胞拿到同一條 barcode。
UMI（單一分子識別碼）哪一個原始分子？PCR 擴增偏差。同一個原始分子的所有副本帶相同 UMI，因此只被計一次。沒有它，被高度擴增的分子會被誤判為高表現。

作答時要講出的結論：原始 read 數不等於表現量。用 UMI 去重，是把 read 換算成分子數的步驟，而定量應該建立在分子數上。

scRNA-seq 對 snRNA-seq 對 PAXgene —— 管子裡到底裝了什麼

三種從組織取得 RNA 的方式，量的不是同一個池子：scRNA 用完整活細胞（細胞質 ＋ 細胞核，主要是成熟 mRNA）；snRNA 只取細胞核（富含內含子與前體 mRNA，沒有粒線體 RNA）；PAXgene 是全血採血管，給出整體總 RNA。

方法輸入RNA 內含何時使用
scRNA-seq完整活細胞細胞質 ＋ 細胞核；以成熟 mRNA 為主；含粒線體 RNA有新鮮組織可立即解離；需要表面標記與全轉錄體解析度。
snRNA-seq分離出的細胞核大量內含子／前體 mRNA；幾乎沒有粒線體 RNA冷凍或庫存組織，或細胞太大／太脆弱無法解離（神經元、心肌細胞、脂肪細胞）。內含子 read 也能提高靈敏度。
PAXgene裝在穩定管裡的全血全部裂解細胞的整體總 RNA；以成熟 mRNA 為主臨床抽血但無法即時處理 —— 這種管子在抽血當下就把表現譜固定住。

設計上的結果：scRNA 與 snRNA 是不可互換的資料集。解離步驟會使 scRNA 對脆弱細胞類型產生偏差，這正是 snRNA 存在的理由。把兩者直接比較而不考慮這一點，是常見的分析錯誤。

逆轉錄 —— 任何 RNA 定序之前的那一步

標準平台無法直接定序 RNA，所以必須先用逆轉錄酶把它抄成 cDNA。這也是為什麼大部分 RNA-seq 偏差是在建庫步驟引入，而不是在定序儀上。

兩個值得帶走的結果：（1）逆轉錄過程中的任何偏差（二級結構、GC 含量、引子效率）都會被最終的計數繼承 —— 那是建庫造成的假象，不是生物學。（2）因為訊息是在擴增之前就被抄錄，UMI 必須在 PCR 之前接上（見上節），去重才會有效。

回想主筆記裡那兩個富集選項 —— poly(A) 抓取（成熟 mRNA）對 rRNA 去除（保留非編碼 RNA 與降解樣本）—— 它們決定的是哪些 RNA 分子一開始能走到逆轉錄這一步。

GTEx —— 讓腫瘤抗原變得安全的正常組織基準線

GTEx（基因型－組織表現）是跨健康人體組織的基因表現參考圖譜。它回答的正是每個靶點背後的安全性問題：這個抗原在健康的某處是否也存在？

筆記裡的實例：NY-ESO-1，一種癌症／睪丸抗原。它作為免疫治療靶點的吸引力，建立在表現僅限於腫瘤與免疫豁免的睪丸 —— 而這個主張就是用 GTEx 查證其在正常體細胞組織中不存在。

這是 L6 靶點條件「組織分布：主要在病灶組織，不在健康組織」的實驗形式，GTEx 只是你去查證的地方。一個在心肌或肝臟也有表現的抗原，無論它在癌症世代中看起來多麼腫瘤專一，都是on-target off-tumour 毒性風險。

降維的另一個選項：MDS（原筆記只寫 PCA／t-SNE／UMAP）

講義在 clustering and dimensionality reduction 一節除了 PCA、t-SNE、UMAP 之外，還列了 MDS（multidimensional scaling）。三者用途相同（把高維表達資料投射到 2D 看分群），差別在保留什麼：

方法保留的是特性
PCA全域變異量（線性）可解釋、但只看線性組合
MDS樣本間距離以距離矩陣為輸入，適合看整體相似度
t-SNE / UMAP局部鄰近關係（非線性）分群漂亮，但距離不可直接解讀、每次結果可能不同
同一個基因組，不同的演奏；定量的關鍵在次序——TPM 先除長度再換算，總和固定一百萬。