ABCT 101 · 第六講 · Proteomics & Multi-omics

📚 第六講 · Proteomics & Multi-omics Prof. Quanhua Mu · 2026-10-07

基因組是零件清單，蛋白質才是機器。學會 bottom-up 量度、DDA 與 DIA 的取捨，並用機制、分佈、可及性判斷標的。

101 · L6 Proteomics & Multi-omics — 由胜肽到藥物標的

第六講 · Proteomics & Multi-omics（Prof. Quanhua Mu，2026 年 10 月 7 日）

ABCT5101 最後一講 — Prof. Quanhua Mu 主講，為 bioinformatics 部分收官。 L4 讀基因組、L5 量度轉錄組，本講量度真正負責執行功能的分子——蛋白質。屬 10 月 14 日期中考範圍（L1–L6）。

必記數字與對比
項目數值
人類基因 → 人類蛋白質約 25,000 個基因 → 約 100,000 種蛋白質（替代剪接、PTM、蛋白複合物）
以蛋白質為標的的 FDA 核准藥物超過三分之二
mRNA–蛋白質相關性一般 r ≈ 0.4；ESCC 中位數低至 0.07
講義圖上的數字82.49% 配對「呈正相關」——但相關係數仍只有約 0.4
單次 LC-MS 產生的數據量數 GB
胜肽碎片離子b-ion（N 端）與 y-ion（C 端）
Target–decoy FDR控制在 1% 以下
最豐富的小分子藥物標的家族GPCR——佔小分子藥物約 33%
ADC 標的排名（2024 進入臨床開發）HER2（9 個）居首，其次 B7H3 與 HER3（各 5），再其次 TROP2／Nectin4／5T4（各 4）
多重定量上限TMT 18-plex——單次 run 比較 18 個樣本

Master Logic 主線邏輯——基因是零件清單，蛋白質才是機器

蛋白質是細胞的功能執行者：疾病狀態、藥物作用、細胞身份，全部在蛋白質層決定。 約 25,000 個基因 → 約 100,000 種蛋白質，原因是一個基因可產生多種產物（替代剪接、PTM、複合物形成）—— 基因數量無法告訴你機器有幾台。同一張投影片上還有商業證據：超過三分之二的 FDA 核准藥物以蛋白質為標的。

層分子-omics 名稱
DNAGenomeGenomics
RNATranscriptomeTranscriptomics
蛋白質ProteomeProteomics
Glycan—Glycomics
代謝物—Metabolomics
脂質—Lipidomics

1 · Key Terms——蛋白質組與研究範圍

蛋白質組學研究四件事：身份、含量、PTM、交互作用。

Proteome（蛋白質組）＝一個生物體、系統或生物情境中所產生的全部蛋白質的集合；proteomics 是對它的大規模研究。研究分兩族：

族內容
結構相關蛋白質結構預測；PTM（轉譯後修飾），如磷酸化
功能相關蛋白質在何時何地表現；生成、降解速率與穩態豐度；在亞細胞區室間移動；參與代謝途徑；蛋白質間交互作用
十秒版本 基因講「有什麼可能」，蛋白質講「實際上發生什麼」。幾乎所有臨床判斷——疾病狀態、藥物標的、生物標記——都在蛋白質層決定，這就是本講存在的理由。

2 · 為何 RNA 不能取代蛋白質

r ≈ 0.4：結構與 PTM 只存在於蛋白層，RNA 測不到。

兩個論點——一個來自生物學，一個來自經濟學：

論點內容
蛋白質的獨特性（vs RNA）獨有資訊只存在於蛋白質——結構與 PTM 狀態無法從 RNA 還原；且 mRNA 與蛋白質相關性低
蛋白質的重要性蛋白質是功能執行者；超過 2/3 的 FDA 核准藥物以蛋白質為標的

相關性「存在但弱」——實測值：

研究相關係數
跨基因（典型平均）r ≈ 0.4
跨樣本（典型平均）r ≈ 0.1–0.5，一般約 0.4
小鼠胚胎發育ρ = 0.41（峰值 0.57）
ESCC multi-omics中位數僅 0.07；只有 15.69% 的配對顯著為正
死後腦組織（AD 世代）中位數 0.085
投影片圖上的陷阱 講義標示 82.49% 正相關（FDR < 5%）。不要誤讀成「RNA 能好好預測蛋白質」。 「82% 的配對呈正相關」與「相關性強」是兩個不同的命題——相關係數本身只有約 0.4。 最強的證據：有團隊嘗試用 RNA-seq 推算的蛋白豐度去配對蛋白質體樣本，自我配對率只有 3.6%。

3 · 蛋白質分子——四層結構

一級到四級；proteomics 聚焦一級（序列）做鑑定與定量。

蛋白質由 20 種胺基酸經肽鍵連成長鏈，一條或多條鏈摺疊成三維形態。結構決定功能。

層級定義對應的生物資訊問題
一級胺基酸序列——backbone torsion，殘基角度如何連成鏈蛋白質鑑定與定量——大多數蛋白質組研究在此層進行
二級局部規則結構：α-helix、β-sheet二級結構預測
三級單鏈完整三維摺疊結構預測（AlphaFold2 的層級）
四級複合物中全部原子的座標與方向複合物結構預測

講義明言：胺基酸序列是蛋白質結構的基礎，因此多數蛋白質組研究聚焦於一級結構—— 這正是整條 LC-MS/MS 管線圍繞「先確定胜肽序列，再推回蛋白質」的原因。

單一蛋白質的結構預測有三條路線：ab initio（基於能量；只適合小蛋白）、fold recognition（比對拓撲，序列相似度低也能用）、homology modelling（用模板；與模板序列相似度低於約 30% 時可靠性大幅下降）。

4 · Bottom-up 標準流程——酶解、分離、離子化、碎裂

Bottom-up 流程：萃取 → 酶解 → LC → 離子化 → MS1 → 碎裂 → MS2。

Bottom-up（又稱 shotgun proteomics）：先將蛋白質酶解成胜肽、分析胜肽、再反推蛋白質。總覽圖的編號路徑就是考試骨架：

  1. 由樣本提取蛋白質——可選胞器富集或親和純化
  2. 將蛋白質酶解成胜肽——可選富集帶修飾的胜肽 ①
  3. 經 LC 分離後，胜肽被離子化 ②，進入高解析度質譜儀
  4. 以約一秒為週期記錄 MS1 譜圖（胜肽同位素模式）③
  5. 選取前驅離子、碎裂、記錄 MS2 譜圖 ④
  6. MS1 與 MS2 寫入磁碟——單次 run 典型達數 GB ⑤——再由蛋白質組軟體分析
Bottom-up 優勢Bottom-up 限制
覆蓋更深、通量更高；適合複雜樣本；技術成熟、標準化修飾位點未被任何胜肽覆蓋時會遺失 PTM 資訊；無法得知修飾組合（proteoform 資訊喪失）；蛋白質推論問題——一條胜肽可能對應多個蛋白質或異構體

Top-down 不經酶解、直接分析完整蛋白質，因此保留完整 proteoform 資訊——代價是技術難度高、動態範圍有限、通量較淺。

考點 取捨核心是深度／通量與 proteoform 完整性。若實驗必須解析PTM 組合或發現新 proteoform，bottom-up 做不到——這是硬性限制，不是偏好問題。

5 · LC 分離與 m/z 原理

LC 按對固定相的親和力分離（滯留時間）；MS 量的是 m/z。

混合物在壓力下由移動相帶動、通過填充固定相的管柱。由於各成分與固定相的交互作用不同，它們以不同速度移動、在不同滯留時間流出。分離由親和力差異驅動，不是分子大小。

實務：胜肽分離採逆相（RP）層析——C18 固定相、水／乙腈梯度配甲酸或乙酸。ESI 是與 LC 串聯的主流離子化方式；MALDI 很少接 LC。

核心公式 m/z =（常數 × m）／ z  ·  m = 質量，z = 電荷。 離子在磁場中偏轉，偏轉半徑只取決於質荷比——所以儀器按 m/z 分離離子、回報 m/z。
儀器「唯一」測量的量 質譜儀唯一測量的量是 m/z，不是分子量。同一分子因電荷不同落在不同 m/z： 500 Da 的胜肽以 +1 讀得 500.0、以 +2 讀得 250.0。 這是 MS/MS 定序的物理基礎——必須先知道前驅離子電荷，才能把碎片質量換算回殘基質量。

6 · MS/MS 與 b/y 離子——以及如何讀譜

b = N 端、y = C 端；b＋y＝整條胜肽的質量。

MS1 按 m/z 分離 → 隔離特定 m/z → 加能碎裂（MS2）→ 碎片再按 m/z 分離 → 記錄 MS2 譜圖。

離子來源攜帶的資訊
b-ionN 端斷裂序列的前綴
y-ionC 端斷裂序列的後綴
考點 b 與 y 互補：兩者質量相加等於整條胜肽的質量（另加水的質量）。 有了這個關係，資料庫搜尋才能把 b/y 質量差換算成胺基酸殘基質量，逐步讀出序列。
不要混淆兩個軸 Chromatogram 沿時間軸——指定 m/z 離子的強度隨時間變化（XZ 平面）。 Mass spectrum 沿 m/z 軸——指定流出時間點的碎裂模式（YZ 平面）。 整體數據是三維的——時間 × m/z × 強度——這就是單次 run 產生數 GB、且不能沿用一般 NGS 管線的原因。

7 · 鑑定的可信度——PSM 與 target–decoy FDR

PSM＝一張譜配一條序列；decoy＝反轉序列；FDR <1%。

PSM（peptide–spectrum match，胜肽–譜圖配對）＝一條實測 MS2 譜圖成功配對到資料庫中的理論譜圖。 由於最高分的 PSM 仍可能是假陽性，流程用 target–decoy 控制 FDR：

  1. 同時搜尋目標資料庫與刻意設計成產生假陽性的誘餌資料庫
  2. 標準做法之一：把目標序列反轉 → 得到自然界不會出現的胜肽
  3. 比較目標與誘餌 PSM 的分數分佈，得出後驗錯誤機率，據此估計並控制 FDR
講義的實例 目標：AAHTEDINACTLTTSPR  →  誘餌：PSTTLTCANIDETHAAR （同一序列反轉）
原理：反轉保留胺基酸組成（演算法無法用質量排除誘餌），但序列不可能自然出現——命中必然是假陽性。 隨機配對平均分佈在兩邊，所以 FDR ≈ 誘餌命中數 ／ 目標命中數，慣例控制在 1% 以下。

8 · 胜肽序列鑑定的三種策略

De novo 能發現新序列；spectrum library 快而準；序列庫最常用。

策略輸入步驟特性
① De novo未知（只用 MS2）確定限制 → 枚舉序列 → 評分 → 排名能發現全新序列；計算複雜度高
② 光譜庫搜尋MS2 光譜庫（實測譜圖）序列–譜圖配對 → 相似度評分 → 排名快速且精度高；但光譜庫難以建立
③ 結構庫搜尋只需蛋白序列模擬理論譜圖 → 比對評分 → 排名快速且廣泛使用
考點 「要發現資料庫中沒有的全新序列，選哪個方法？」答案只有一個：de novo——另外兩種都需要既有函式庫。 另注意 ② 與 ③ 的分別：光譜庫存的是實測譜圖；結構庫由序列模擬理論譜圖。

9 · 採集模式——DDA vs DIA

DDA 揀 top-N 偏高豐度；DIA 全部碎裂——更深、更重現，但 FDR 難控。

DDA · Data-Dependent AcquisitionDIA · Data-Independent Acquisition
原理MS1 概覽掃描後，選強度最高的 top-N 前驅離子（N 通常 10–20）進行碎裂把整個 MS1 m/z 範圍切成固定視窗（1 Da 或 10 Da），視窗內每個離子都碎裂
優點方法簡單；譜圖品質高、複雜度低；易於鑑定；適合建光譜庫不需事先知道樣本蛋白質組成；覆蓋更深；精度與重現性優於 DDA；高度多重化；數據可重新分析
缺點偏向高豐度蛋白、漏掉低豐度訊號；動態範圍有限；易出現缺失值；大世代重現性不穩譜圖高度多重化；假發現率較高（FDR 較難控制）；成本高於 DDA；需要光譜庫
學生最常答錯的三點 ① 「不需要事先知道樣本」是 DIA 的優勢，不是 DDA——最常見的張冠李戴。
② 深度與重現性偏 DIA；譜圖品質與易解讀偏 DDA——方向相反。
③ FDR 較高與成本較高是 DIA 的劣勢，不是 DDA。

10 · 定量策略

Label-free 比 MS1；isobaric（TMT）的 reporter 在 MS2 低質量區。

方法訊號出現的位置
Label-free跨 LC-MS run 比較萃取離子層析圖中各胜肽特徵的強度
MS1 標記法多個樣本以不同同位素標記模式出現在 MS1 譜圖
等量標記（isobaric）定量訊號是MS2 低質量區的報導離子（reporter ion）
必記 報導離子位於 MS2 的低質量區。與 ADME 章同一原理：MS1 告訴你「是什麼」（鑑定）；MS2 的報導離子告訴你「有多少」（定量）。 TMT 有 6／10／16／18-plex——單次 run 最多比較 18 個樣本；SILAC 與 iTRAQ 亦屬等量標記。
  • LFQ（如 MaxLFQ）——由胜肽強度推斷相對蛋白豐度
  • Spectral counting——以鑑定到的胜肽數量近似豐度；簡單但受深度影響
  • PRM／SRM／MRM——靶向採集，高精度定量，也是絕對定量的路徑
  • 3D 與 4D 蛋白質組——3D 用滯留時間、m/z、強度；4D 加離子遷移率（CCS），可分辨 m/z 相近但形狀、大小、電荷不同的胜肽

11 · 由數據到發現——矩陣、詮釋、應用

數據矩陣：行＝蛋白質群、欄＝樣本；詮釋才是最費工的部分。

當蛋白質在眾多樣本中被鑑定與定量後，結果是一張矩陣：列 = 蛋白質（或蛋白質組）、欄 = 樣本、格 = 豐度或豐度比。

本講最重要的一句話 講義明言：對定量蛋白質或 PTM 數據的詮釋、並轉譯成生物或生物醫學發現，是研究中最重要、也最費工的部分。
對商業／BD 方向而言這是必記一句：蛋白質組學的瓶頸不在數據產生，而在詮釋。儀器賣的是數據；價值在詮釋中產生——這正是生物資訊服務存在的理由。

應用——講義的管線圖把蛋白質組學放在整個開發弧線上：

階段蛋白質組學的貢獻
臨床前標的識別與驗證；先導物發現與優化（分子對接）；in vitro／in vivo 研究（藥物毒性與效力）
臨床臨床試驗；生物標記用於分層與治療反應

旗艦計劃：CPTAC——Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium（proteomics.cancer.gov/programs/cptac），串連組織來源站、蛋白質體鑑定中心與數據分析中心的 proteogenomic 管線。

12 · 什麼是好標的？

好標的三條件：機制參與、組織分佈、可及性。

準則含義
機制參與參與疾病機制，且對其他生物程序參與極少
組織分佈主要分佈於病變組織、而非健康組織
可及性藥物分子在物理上能到達

可及性的實例——kinase 樹：CML 的 BCR-ABL 之所以可成藥，是因為 imatinib 能嵌入其 ATP 口袋、阻斷訊號。 亞細胞定位同樣關鍵（參考 Human Protein Atlas，proteinatlas.org）：MYC 位於核質；EGFR 分佈於高基氏體、細胞膜、細胞核、細胞接合等多處——同一細胞，可及性截然不同。

連接 ADME 章——為何定位決定可行性 細胞膜通透性決定藥物能否到達，而這取決於藥物的離子化狀態 （第 3 章：pH = pKa + log([A−]/[HA])）。離子型藥物穿不過脂質雙層。 這句就是把 L6 的標的選擇接回藥理學區塊的橋樑。
模態標的要求
小分子藥物本身要能到達——受限於膜通透性與 pKa
ADC標的在細胞表面：抗體不需穿膜；接合的毒素在內吞後進入細胞
CAR-T標的須高度腫瘤特異，避免 on-target off-tumour 毒性
考點 ADC 的邏輯是「把藥送到標的細胞」：抗體負責辨識、毒素負責殺傷、linker 決定釋放時機。 經典錯誤：以為抗體能自由穿透細胞膜——它是大分子，做不到。

13 · 三個案例的數字

三個案例數字：GPCR 約 33%；HER2 居 ADC 榜首；CAR-T＝覆蓋＋特異＋穩定。

① 小分子標的（Nature Reviews Drug Discovery, 2016）：按標的家族劃分小分子藥物—— GPCR 約 33%、離子通道約 18%、核受體約 16%、kinase 約 3%、其他約 30%。 GPCR 是最豐富的單一標的家族——與「kinase 主導」的直覺相反，值得記住。

② ADC 標的（2024 年進入臨床開發的 ADC）：HER2（9 個）居首，其次 B7H3（5）、HER3（5），再其次 TROP2、Nectin4、5T4（各 4）、DLL3（3），之後是長尾（PTK7、FRα、GPC3、B7H4、ROR1、NaPi2b、cMET、CD30、CD33、CDH17、CD228、CEA／CD66、CD56 等）。 亦見雙特異組合：TROP2×HER3、B7H3×PDL1、EGFR×TROP2、EGFR×cMET。

③ CAR-T 標的選擇（J. Hematol. Oncol., 2019）——三大決定因素：

決定因素主要作用選擇準則
Coverage 覆蓋度腫瘤清除效率表現量須足夠高（抗體或 CAR-T 可達 CRR 反應）；參考相關抗體藥物的效力；治療前先測患者樣本
Specificity 特異性「Off-tumor」細胞毒性侷限於腫瘤組織，或脫靶損傷可耐受／可妥善處理；參考相關抗體的副作用
Stability 穩定性反應持續時間與復發表現穩定、不易受外部訊號調控；標的對癌細胞的生長與存活必須重要

CAR-T 流程（Cleveland Clinic 圖）：抽血 → 分離 T 細胞 → 基因改造使其表現嵌合抗原受體 → 擴增至數百萬細胞 →（治療前先化療）→ 回輸。 標的示意：CD19 與 CD22 貫穿 B 細胞發育——正是 B 細胞惡性腫瘤治療所用的譜系標記。

14 · 蛋白質組的調控——轉錄 vs 轉譯

轉錄與轉譯兩層都有調控——這正是 mRNA ≠ 蛋白質 的原因。

蛋白質量不是單一層的產物，而是多層調控疊加的輸出：

轉錄調控（DNA → RNA）轉譯調控（RNA → 蛋白質）
拷貝數 · 轉錄因子活性 · DNA 甲基化 · 組蛋白修飾 · 染色質可及性 · 3D 基因組RNA 修飾（m6A、polyA）· 非編碼 RNA（miRNA、lncRNA）· 整體轉譯控制（mTOR、壓力反應）· mRNA 結構
「相關性低」的機制層答案 轉錄控制造出多少 mRNA；轉譯控制造出多少蛋白質。 蛋白質量 = 拷貝數 × 轉錄效率 × 轉譯效率，再除以降解速率—— 所以 mRNA 量相同，蛋白質量可以差很多。這就是 RNA 不能取代蛋白質組學的原因。

15 · Metabolomics 與 multi-omics 視角

代謝物＝小分子基質、中間物、終產物；multi-omics 的存在是為了看湧現。

代謝物（metabolites）是細胞代謝的小分子基質、中間產物與終產物。 關鍵詞是「小分子」：代謝物可直接用 LC-MS 分析、無需酶解——是蛋白質組學的天然夥伴層。

核心概念：湧現（emergence） 整體的行為無法由其零件的行為推導出來。整體不等於部分之和。
  • 盲人摸象——每位研究者只摸到大象的一部分；任何單一 omics 都只是部分真相，只有整合才能還原全貌。
  • 「生物學家能修好一台收音機嗎？」（Cancer Cell, 2002）——反對純粹還原論的警告：把系統拆散、逐件研究，可能已經丟失了關鍵資訊（重點是接線，不是零件）。
考點——模範答案 「需要 multi-omics，是因為各 omics 層之間的相關性並不完美（mRNA–蛋白質只有約 0.4），且調控發生在多個層次（轉錄、轉譯、PTM、降解）——單一層級只能顯示系統的一個切片。」
排除項：技術準確度不是原因（每層都可準確、但仍可互相矛盾）；multi-omics 成本更高、不是更低；整合不會減少樣本數需求。

16 · 生物網絡——由零件到系統

生物網絡：disease network 的 node 是疾病；disease gene network 的 node 是基因——別對調。

網絡就是一組互相連接的節點（node＝基本單元；edge＝連結；數學表示 G = {N, E}）。 整合 multi-omics，就是把不同層的數據掛上同一個網絡，找出多層同時指向的節點。 Hub 是高度連接的節點——在生物學中通常功能重要且具多效性（pleiotropic）。

網絡節點連結編碼
Human disease network （PNAS 2007）一種疾病兩個疾病共有的基因節點顏色＝疾病類別；節點大小＝基因數
Human disease gene network （PNAS 2007）一個基因涉及同一疾病的兩個基因相連節點大小＝該基因涉及多少種疾病
Drug–target network （Nat Biotech 2007）藥物（圓形）與標的蛋白（方形）FDA 核准藥物與其標的的已知關聯節點大小＝degree；節點顏色＝GO／解剖治療化學分類
經典混淆——兩個方向相反的網絡 出題者最愛偷換：
· disease network：節點＝疾病，連結＝共有的基因 → 顯示疾病共病關係
· disease gene network：節點＝基因，連結＝同一疾病的基因對 → 顯示共同的疾病背景

分析方法以融合（fusion）整合各層：例如 patient-similarity network fusion（Nature Methods, 2014）——先為每個 omics 層建一張相似度網絡，再迭代融合成單一、由全部數據支持的病人網絡。

17 · Exam Focus 考點

  • 數字：25,000 → 100,000；>2/3 藥物以蛋白質為標的；r ≈ 0.4（與 82.49% 陷阱）；單次 run 數 GB；FDR <1%；GPCR 約 33%；HER2 為 ADC 榜首；TMT 18-plex
  • 方向：b-ion 來自 N 端（前綴）、y-ion 來自 C 端（後綴）；誘餌是反轉序列
  • 選擇題：全新序列 → 只有 de novo；不需先驗知識＋深度／重現性 → DIA；譜圖品質＋建庫 → DDA
  • 兩個疾病網絡：disease（節點＝疾病）與 disease gene（節點＝基因），切勿對調
  • 標的準則：機制參與／組織分佈／可及性——及模態差異（小分子要穿膜、ADC 認表面、CAR-T 要特異）
  • Bottom-up vs top-down：分界線在 proteoform 完整性

講義自己的數字——複雜度階梯與相關性分布（slide 8）

投影片的階梯是 ~25,000 基因 → ~100,000 轉錄本 → >100,000 蛋白質 → >1,000,000 proteoform；而全部 mRNA–蛋白質配對中，82.49% 為正相關、17.51% 為負相關，但只有 39.63% 達到 FDR < 5%。

階梯層級數字為何逐級放大
編碼蛋白質的基因~25,000基因組——零件清單
轉錄本~100,000選擇性剪接：一個基因可產生多種轉錄本
蛋白質>100,000轉譯層次的調控：轉錄本數目不等於蛋白質數目
Proteoform>1,000,000轉譯後修飾（磷酸化、醣基化等）再把每個蛋白質乘開

同一張投影片上的三個相關性數字——必須一起讀，不能只看其中一個：

數字它真正表達的命題
正相關 82.49%多數配對方向一致——這是關於正負號的陳述，不是強度的陳述
負相關 17.51%約六分之一的配對方向相反——mRNA 上升、蛋白質下降。正是這些案例會讓 RNA-seq 主動誤導你
達 FDR < 5% 者：39.63%最誠實的數字——「正相關」的配對中，不到一半通過統計檢定。這才是 RNA 真正能帶你走多遠
⚠️ 考試陷阱82.49% 是「正相關的比例」，不是「相關性強」——相關係數本身只有約 0.4。若題目用 82.49% 引你選「RNA 可取代蛋白質」，正確答案是不可以，因為只有 39.63% 通過 FDR<5%。

m/z 背後的物理——以及講義對 MS2 與誘餌的兩個命名（slides 13、15、20）

離子在磁場中運動會被偏轉，半徑 r = mv / (zB) = 常數 × m/z——半徑只取決於 m/z，這正是質譜儀能夠分離離子的全部物理理由。講義另外把 MS2 的碎片稱為 product ion（產物離子），並以 sequence reversing（序列反轉）建立誘餌資料庫。

  • 公式逐項拆解——m 為質量、v 為速度、z 為電荷、B 為磁場強度。固定 v 與 B，r 就隨 m/z 縮放，所以儀器本質上是一把 m/z 的尺。這條公式墊在整講的最底層：LC 依化學性質分離（滯留時間），MS 依 m/z 分離。
  • 講義原文中的 MS/MS——前半段與一般質譜相同；差別在於把某個 m/z 的離子再收集起來，加能量令其碎裂，再把碎片重新分析，產生二級質譜（MS2）。這些碎片就是 product ion；對胜肽而言是 b-ion（N 端前綴）與 y-ion（C 端後綴）。
  • 誘餌如何產生——序列反轉——講義把目標胜肽反轉，得到自然界不存在的序列：目標 AAHTEDINACTLTTSPR → 誘餌 PSTTLTCANIDETHAAR。同時搜尋兩個資料庫、比較兩者的分數分布，即可算出後驗錯誤機率（posterior error probability），這正是設定 FDR 門檻（一般 <1%）的依據。

講義自己的總結——四句話（slide 35）

講義以四點作結：蛋白質組學研究結構與功能；它帶來其他體學無法提供的視角；LC–MS/MS 是目前最廣用、最強大的平台；而藥物開發與生物標記發現是它的主要應用。

#講義的總結句為何可考
1蛋白質組學是研究細胞或生物體所產生之全部蛋白質的結構與功能一句定義——注意它同時涵蓋結構與功能，正對應第 1 節的兩大研究家族
2蛋白質組學能為生物學研究帶來寶貴的視角與洞見「為何值得做」的正當性
3LC–MS/MS 是目前最廣泛使用、也最強大的蛋白質組鑑定與定量方法平台答案。它同時做鑑定與定量——這正是 MS1 與 MS2 兩者都不可少的原因
4藥物開發與生物標記發現是蛋白質組學的主要應用「所以這」的答案。請與第 11 節對讀：儀器生產數據，但詮釋才是價值與成本真正所在

Trypsin —— 定義 bottom-up 蛋白質體學的那個酶

Shotgun（bottom-up）蛋白質體學測的不是完整蛋白質，而是先把它們切開，而標準蛋白酶是 trypsin（胰蛋白酶），在離氨酸與精氨酸之後切開（若後面接脯氨酸則不切）。後面每一步都建立在這個規律上。

為什麼偏偏是 trypsin：在 K 與 R 之後切開，得到的肽段（i）長度落在適合 LC-MS 的 6–20 個殘基區間，（ii）末端是鹼性殘基，因此帶有穩定的正電荷、在 MS2 中可預測地碎裂 —— 這正是 b 離子與 y 離子階梯之所以讀得懂的原因。

代價是什麼：消化會切斷肽段之間的連結。你只能從看見哪些肽段去推論原本存在哪一個 proteoform，而在異構體之間（或蛋白質家族成員之間）共有的肽段本質上就是模糊的 —— 這是眾所周知的蛋白質推論問題。量測完整蛋白質的 top-down 蛋白質體學可以避開它，但難得多。

乙醯化 —— 該與醣基化並列的那個 PTM

除了醣基化與雙硫鍵，第三個值得叫出名字的 PTM 是乙醯化：加上一個乙醯基，最重要的兩處是組蛋白尾部（染色質鬆開、轉錄活化）與 p53（調節其腫瘤抑制活性）。

PTM主要功能後果典型例子
醣基化溶解度、摺疊、受體結合、血清半衰期Fc 醣基化；去岩藻糖化提升 ADCC
乙醯化中和離氨酸上的電荷 → 染色質鬆弛與轉錄活化；也調節蛋白質穩定性與活性組蛋白尾部；p53
雙硫鍵穩定三級／四級結構抗體的鏈內與鏈間鍵結

為什麼它該出現在藥學課程裡：乙醯化是一整個藥物類別背後的機制 —— HDAC 抑制劑讓組蛋白維持乙醯化、染色質保持開放，BET 抑制劑則阻斷辨識乙醯化離氨酸的讀取蛋白。這也是組蛋白密碼被視為「可寫入」而非固定的原因。

Target-decoy FDR —— 要記公式，不是只記概念

誘餌資料庫是把真實序列反轉或隨機重排做出來的，錯誤發現率估計為 FDR ＝（誘餌命中數／目標命中數）× 2。門檻定在 <1% FDR，代表每一百個被報告的鑑定中，預期錯不到一個。

一句話講完邏輯：誘餌序列不存在於樣本中，所以任何配對到它的結果都必然是偽陽性。誘餌命中數因此估計了藏在目標命中數裡的偽陽性數量。

為什麼要乘以 2：目標與誘餌資料庫大小相同，所以目標比對中的偽陽性數量應該大致等於誘餌命中數 —— 但一般回報的 FDR 是對全部被報告的命中（目標 ＋ 誘餌）來算的，因此要有乘 2 這個標準校正。

為什麼這比表面上看起來重要：一次蛋白質體學實驗同時做了數萬次「光譜對肽段」的比對。不做這個校正，單純的 p 值門檻會放進大量錯誤鑑定 —— 這與轉錄組學需要用 BH 校正後 p 值（L5）是同一個多重檢定問題。

TMDD —— 靶點介導的藥物處置

TMDD 描述的是一種藥物，它自己的靶點顯著影響它自身的藥物動力學：藥物與靶點結合，複合物一起被內化並一起降解，於是靶點成為一個把藥物從循環中抽走的「 sink」。

為什麼這是生物藥的特徵：高親和力結合，再加上靶點含量不可忽略，使得清除途徑不只是腎臟或蛋白水解代謝 —— 還有被靶點本身消耗掉這一條。這在針對膜受體或針對大量可溶性配體的抗體上最明顯。

藥物動力學上的特徵：清除率是非線性且隨劑量而變的。低劑量時靶點 sink 主導，所以增加劑量會讓暴露量超比例上升；高劑量時靶點被飽和、sink 滿了，藥物動力學又回到線性。若暴露量對劑量的曲線不成比例，先懷疑 TMDD，再懷疑檢驗誤差。

給藥上的結果：這解釋了為什麼有些抗體需要先給負載劑量把靶點 sink 填滿，之後的維持劑量才會表現得可預測 —— 必須先把 sink 飽和，暴露量才會正常地隨劑量縮放。

考試點TMDD 是 L6 靶點生物學與藥理學區塊之間的橋：它是「靶點含量」對 PK 造成的影響，不是對療效的影響。其辨識特徵是非線性、隨劑量而變的清除率 —— 而不是親和力的改變。

蛋白質體的「規模數字」（投影片 p3–p8，原筆記未收）

層級數量意義
蛋白編碼基因~20,000基因體提供的「零件清單」
蛋白質體（含剪接、修飾）>100,000一個基因可產生多種蛋白異構體
質譜可偵測的蛋白~25,000（講義數字）視樣本與深度而定

這就是「基因體是零件清單，蛋白質體才是機器」的由來：轉錄本數量已經是基因數的數倍，蛋白質再加上剪接與轉譯後修飾，複雜度再上一層。

另外講義開頭比較了三種轉錄組／蛋白質組取樣方式：bulk（整塊組織）、single-cell（單細胞）、spatial（空間轉錄組）——差異在「平均掉異質性」與「保留位置資訊」之間的取捨。

MS/MS 的 b／y 離子與兩層調控（投影片 p12、p39–p41）

肽段定序的化學：MS/MS 把肽段打斷在肽鍵上，產生兩組片段——b 離子保留 N 端、y 離子保留 C 端；相鄰 b 離子（或 y 離子）之間的質量差，就等於一個胺基酸的質量，於是可以逐個讀出序列。這也是 de novo sequencing 的基礎。

層級調控方式（投影片列出的六項／四項）
轉錄① 拷貝數（copy number）② 轉錄因子活性 ③ DNA 甲基化 ④ 組織蛋白修飾 ⑤ 染色質可及性 ⑥ 3D 基因組
轉譯① RNA 修飾（m6A、polyA）② 非編碼 RNA（miRNA、lncRNA）③ 全局控制（mTOR、壓力反應）④ mRNA 二級結構
為何要記這兩層 同一個基因的 mRNA 量相同，蛋白量可以差很多——因為轉譯效率與降解速率不同。所以 proteomics 不能只用 transcriptomics 推論。

網絡分析的基本量（投影片 p51–p65）

概念定義為何重要
Node（節點）網絡的基本單位：基因、蛋白、疾病或藥物先把「什麼和什麼相連」定義清楚
Edge（邊）兩個節點之間的連結（有向／無向）方向決定因果還是相關
Degree（度）一個節點有幾條邊；<k> 為平均度Hub＝高度節點，常是關鍵調控者或藥物靶點
Power law（冪律）P(k) ∝ k−γ，γ 通常 2–3少數 hub 連接大多數節點——生物網絡的典型結構

講義用三個實際網絡示範：human disease network（疾病–疾病，共用基因者相連）、drug–target network（藥物–靶點二分圖）、以及多組學整合網絡（把基因體、轉錄體、蛋白體、代謝體疊在同一張圖上找共同模組）。

基因組是零件清單，蛋白質才是機器；bottom-up 量度、DDA/DIA 二選一、標的看機制、分佈與可及性。