• 蛋白是 true gene products 真基因產物，與體內幾乎一切互作，調控各類生理反應
• 五項理由：① Diverse functions 功能多樣（催化、訊號、免疫）；② High specificity 高特異性；③ Therapeutic versatility 治療多面性（荷爾蒙、酶、抗體）；④ Complex interactions 複雜互作（小分子做不到）；⑤ Biotech advancements 生技進展（重組 DNA、mAb）

• 四級結構：primary 初級→secondary 二級（α-helix/β-sheet）→tertiary 三級（3D 摺疊）→quaternary 四級（次單元）
• 功能蛋白精確扭曲、摺疊、盤繞成獨特形狀（三級與四級）；其 3D 形狀與 改變構形 conformation 的能力使其執行特定功能
• Denaturation 變性＝失去形狀＝失去功能

1. Plasmid manufacturing 質體製造 — 載體選擇＋基因插入
2. Transformation 轉化 — 送入宿主（E. coli／yeast／CHO）＋篩選
3. Expression 表現 — 培養＋誘導
4. Purification 純化 — 管柱結合、洗脫、size-exclusion chromatography 尺寸排除層析

• Hybridoma tech（1975）：融合產抗體 B 細胞＋不死性骨髓瘤細胞→無限 mAb
• Structure 結構：IgG＝2 重鏈＋2 輕鏈，Y 形，~150 kDa（2×50＋2×25）
• CDRs（共 6 個：3 重＋3 輕）＝抗原結合位（paratope）→特異性
• Single epitope 單一表位：mAb 只認一個抗原決定位，高度標靶
• Fc region functions：結 Fc 受體→ADCC／吞噬；活化補體（C1q）；經 FcRn 穿胎盤＋延長半衰期

• ADCC — NK 細胞／巨噬細胞結 Fc 殺靶（perforin／granzyme）
• Inhibitory 抑制 — 阻受體／中和細胞因子／下調受體
• CDC — 補體介導溶解

• Nomenclature 命名：單株抗體名常以 "-mab" 結尾；"-tu" 指腫瘤（如 rituximab、cetuximab）
• Limitations 限制：開發與生產 複雜且昂貴；可能伴輸注反應與 immunogenicity 免疫原性
• Applications 應用：研究（蛋白功能、訊號、疾病機制；抗體 assay 與影像）；診斷（ELISA、IHC、flow cytometry）；治療（癌症、自免、感染）

• 雙硫鍵被還原劑 DTT、TCEP、mercaptoethanol 切斷→SDS-PAGE 出 兩條帶（重鏈、輕鏈）
• 估算大小：50×2＋25×2＝150 kDa——這是 150 kDa 數字的實驗根據
• V＝variable 變異區·H＝heavy 重鏈·L＝light 輕鏈·C＝constant 恆定區
• CDRs（各變異區有 CDR1/2/3）→每抗體 6 個；組成 paratope 互補位，直接與抗原 epitope 表位 互作；CDR 序列多變性使抗體能辨認海量抗原

Inhibitory effect 抑制作用（3 路）：① receptor blocking 受體阻斷——阻止自然配體（生長因子）結合→抑制增殖／存活訊號；② neutralisation of ligands 配體中和——直接結循環細胞因子／生長因子；③ receptor downregulation 受體下調——引發受體內吞降解，減少表面受體數。

• Krystexxa（recombinant uricase）：治 慢性痛風，將尿酸轉為較可溶的 allantoin 尿囊素，降尿酸；i.v. 每 2 週輸注一次。痛風＝發炎性關節炎（痛、腫、紅），由尿酸結晶堆積引起；高嘌呤飲食（紅肉、貝類、酒）升尿酸；肥胖與家族史易感
• Pancrelipase（Creon、Pancreaze）：治外分泌胰臟功能不全，替代消化酶 lipase、protease、amylase
• Asparaginase（Elspar）：治 急性淋巴性白血病 ALL 與部分淋巴瘤（尤兒童），分解 asparagine 耗竭白血病所需；部分 PEGylated 以改善藥動（同 L1 脂化延半衰期的邏輯）

月經週期荷爾蒙：oestrogen、progesterone、luteinising hormone、FSH 及其受體。IVF 荷爾蒙：GnRH antagonists＋hCG（human chorionic gonadotropin）——hCG 是 237 胺基酸糖蛋白異二聚體。

1. APCs（樹突細胞、巨噬細胞）辨認外來蛋白
2. APCs 吞噬 蛋白、處理，並以 MHC 分子於表面呈現碎片
3. APCs 移往 淋巴結，將碎片呈給 naive T cells 初始 T 細胞
4. 辨識碎片的 helper T cells 輔助 T 活化並增殖
5. 活化輔助 T 分泌 cytokines 細胞因子 刺激 B 細胞
6. 受刺激 B 細胞分化為 plasma cells 漿細胞，產特異抗體
7. 部分活化 B 成 memory B cells 記憶 B 備未來快速反應
8. 輔助 T 也促 cytotoxic T cells 毒殺 T 直接殺感染細胞
9. 循環抗體於再暴露時 neutralise 中和 病原；記憶 B／T 快速強反應→長期保護

• Nanobody — 駱駝科單域，12–15 kDa；穿透／穩定佳但半衰期短（腎清除）、無 Fc 效應
• Humanization 人源化 — 以人框架換鼠框架（減抗藥抗體）
• Peptibody — 胜肽＋Fc 融合；例 Romiplostim（Nplate，血小板減少症）
• ADC — 抗體＋linker＋細胞毒 payload；例 Mylotarg。步驟：結合→內吞→linker 切→毒藥殺細胞
• Bispecific 雙特異 — 結兩抗原。IgG 樣（有 Fc、穩）vs 非 IgG（scFv、無 Fc）。Knob-into-hole 解隨機鏈配對

單域抗體片段源自 camelids 駱駝科（llamas、camels），保留全尺寸結合力而體積僅 ~12–15 kDa（對 150 kDa）。

治療抗體初於動物（常小鼠）開發因其對人抗原產強免疫；但動物抗體被判外來，產 anti-antibody antibodies 抗抗體 降效並引反應。人源化在保留標靶結合下以人序列替換非人部分。

胜肽提供生物活性；Fc 區提供穩定與延長循環。例：Romiplostim（Nplate）——擬 thrombopoietin 血小板生成素 刺激血小板生成，治 thrombocytopenia 血小板減少症。

ADC 是標靶癌症療法，結合 抗體 與 細胞毒藥。三組件各有所司：

1. Target binding 標靶結合——抗體結癌細胞表面抗原
2. Internalisation 內吞——ADC-抗原複合體經 endocytosis 胞飲 入細胞
3. Linker cleavage 連接子切斷——細胞內切斷，釋藥
4. Cytotoxic action 細胞毒作用——干擾關鍵過程（如 DNA replication 複製）
5. Selective killing 選擇性殺傷——標靶遞送減少傷健康細胞
6. Cell death 細胞死亡——藥物累積誘 apoptosis 凋亡

為何雙特異難造：鏈結構相似、random assembly 隨機組裝、lack of natural pairing 無自然配對機制、複雜工程需求。解法：knob-into-hole mutations 強迫重鏈正確配對。

• Diagnostics 診斷——ELISA、lateral flow assays 側流（如驗孕）、IHC
• Research tools 研究工具——Western blotting、flow cytometry、immunoprecipitation
• Biosensors 生物感測器——偵測環境與臨床樣本中的病原、毒素或分析物

• Hypothesis 假說：用 化學而非基因工程 造新型雙特異，大幅降生產時間與成本 並簡化 R&D。益處：減人力·降成本·減時間·簡 R&D·可放大
• Bioconjugation 生物偶聯：從環肽出發——high stability 高穩定抗酶解 與 constrained conformation 受限構形 利標靶結合；與抗體結合得 pBsAb 胜肽雙特異，reduced immunogenicity 降免疫原性

驗證邏輯（作業題有用）：

• SDS-PAGE 與 LC-MS 不同條件偶聯反應；stability experiment 3 天後穩定度
• ELISA binding 測 mAb 與 pBsAb 對 EGFR 與 SIRP-alpha
• Confocal 與 flow cytometry 選擇性結合 EGFR 過表現細胞與巨噬細胞
• Macrophage-engaging assay：種癌細胞鋪滿 96 孔→加螢光標記巨噬（RAW264.7）與 PBS／mAb／pBsAb→作用 10 分→倒轉洗→螢光鏡拍→計數巨噬
• 3D 腫瘤模型：HT29 3D spheroid 共聚焦 Z-stack 測 spheroid infiltration 球體浸潤
• 阻斷「don't eat me」信號：CD47–SIRP-α binding assay ELISA——阻 CD47 讓巨噬吞噬腫瘤；加 serum stability 血清穩定度

• ADCC (NK) → Fc 拉 NK，放 perforin／granzyme 誘凋亡
• ADCC (macrophage) → Fc 結合→吞噬靶細胞
• CDC → 抗體結 C1q 活化補體溶靶
• ADC → 結合→內吞→linker 切→毒藥殺細胞（抗體是地址，linker 是時程）
• pBsAb → EGFR 臂＋抗 CD47/SIRP-α 臂，橋接腫瘤與巨噬，阻「别吃我」信號

• Bispecific bottleneck → 僅 9 個獲批 vs 200+ 在試驗；鏈配對難即護城河
• Wong pBsAb → 化學偶聯代基因工程，2–3 天→6 小時；專利＋分拆 Abismuno
• Columvi → 雙特異全療程約 US$350k（HK$2.5M），顯商業價值
• Pricing → 首週期 <80 kg 為 US$20,112；≥80 kg 為 US$26,816（HK$198,000）

1. 用目標抗原（課堂例子：HER2）免疫小鼠 → 脾臟充滿特異性 B 細胞
2. 取出脾臟 B 細胞，與小鼠 myeloma cells（骨髓瘤細胞）混合
3. 用 PEG（聚乙二醇）或 electrofusion 電融合
4. HAT 培養基篩選 → 只有融合成功的雜交瘤存活
5. 有限稀釋（約 1 細胞／孔）→ 逐孔篩出只分泌目標抗體的單株

• Papain／Pepsin 是蛋白酶 → 切主鏈 → 切成結構域
• DTT／TCEP 是還原劑 → 只斷二硫鍵 → 切成鏈

CH2 帶 Fc N-糖基化位點 Asn297 並結合 C1q；鉸鏈區提供柔性與重鏈間二硫鍵。CDR = 特異性；Fc = 效應功能 + 半衰期。

1. Fab 結合靶細胞抗原（課堂例子：Rituximab → B 淋巴瘤細胞的 CD20）
2. 結合後的抗體暴露 Fc
3. NK 細胞經 FcγRIIIa（CD16） 辨識並活化
4. 釋放 perforin（穿孔素）+ granzymes（顆粒酶）；穿孔素在靶細胞膜打孔
5. 顆粒酶入內 → 活化 caspase 級聯 → 靶細胞凋亡

1. 定序雜交瘤抗體的鼠 VH、VL 基因
2. 用 Kabat 或 Chothia 編號辨識 6 個 CDR（重 3 + 輕 3）
3. 選與鼠可變區同源性最高的人種系骨架
4. 把 6 個鼠 CDR 移植到人骨架對應位置
5. 回突變：把支撐 CDR 構象的骨架殘基還原為鼠序列（Vernier zone）
6. 表達並驗證；親和力通常下降 → 需迭代優化

人源化勝過嵌合的邏輯：外來序列少 → 抗藥物抗體少 → 被中和少 → 療效可長期維持。

• Nanobody 來源：駱駝科（駱駝、羊駝；課堂亦提鯊魚）天然產生 HCAb（僅重鏈抗體），結合能力全落在單一重鏈可變域 VHH，僅 12–15 kDa
• 優勢：極小 → 深入實體瘤、可穿血腦屏障；極穩定（耐 60–80 °C、耐有機溶劑）；可用大腸桿菌／酵母低成本量產；可達隱藏表位
• 劣勢：半衰期短（數小時，腎清除快）；無 Fc → 無 ADCC／CDC；駱駝來源 → 有免疫原性風險
• 救半衰期兩法：PEG 化 VHH（增大水動力半徑）；或融合人 Fc（保留小尺寸標靶能力，兼得 FcRn 回收與 ADCC）
• Peptibody = 具療效的肽 + 人 IgG1 Fc → 肽提供活性，Fc 提供穩定與長循環；連接子（課堂例子 (GGGGS)n）須讓肽正確摺疊並結合靶點，又不遮蔽 Fc 自身受體結合；活性檢測須同時驗證兩端

• 載荷選擇標準：極高毒性（IC50 在皮莫耳級）＋機制明確
• 旁殺效應：中性親脂的 MMAE 可擴散出抗原陽性細胞，殺死鄰近抗原陰性癌細胞 → 克服腫瘤異質性；帶電的 DM1 不能過膜 → 無旁殺效應
• DAR（藥物抗體比）= 每抗體平均載荷數。Enhertu (DS-8201) 屬高 DAR（約 8）、可裂解連接子、強旁殺效應，用以克服 T-DM1 (Kadcyla) 抗藥；Kadcyla 則是不可裂解、無旁殺效應的設計。Mylotarg 是首個 ADC（CD33、calicheamicin），因毒性撤市後以較低劑量重新獲批

• 供應受製造難度壓縮 → 已批 9 個雙抗 vs 200 多個在臨床試驗；鏈配對是瓶頸 → 三種解法各代表額外製程開發、純化與分析 → 技術稀缺即可支撐高定價
• Columvi 是「療程價」，不是無限期月費 → 固定療程設計，約 8.5 個月完成。把 US$350,000 講成一次性、有終點的療程，才使它站得住腳 —— 這正是課堂把金額與療程長度綁在一起講的原因
• 第三個對照：非 IgG 形式如 blinatumomab 無 Fc、無 FcRn 回收 → 半衰期縮到數小時 → 必須連續靜脈輸注（課堂提及攜帶式泵、約四週）→ 這是「給藥成本模型」而非「製造成本模型」

• 訊號肽 Signal peptide → 蛋白合成時帶訊號肽，運送過程中被蛋白酶切除（即 PTM 的蛋白水解切割；經典例子 proinsulin → insulin）。重組生產刻意在質體加入訊號肽序列 → 產物分泌到胞外而非困在胞內 → 純化更容易
• Th1 vs Th2 極化 → naive CD4+ T 細胞的 TCR 結合 MHC class II–肽複合物、同時 CD28 結合 CD80/CD86 提供第二訊號 → 活化、增殖 → 極化成 Th1 或 Th2 → 決定下游免疫反應性質
• 加強針為何有效 → 首次免疫時 naive B／T 細胞少 → 效價低、以低親和力 IgM為主；生發中心內 B 細胞進行體細胞高頻突變與類別轉換（IgM → IgG，酵素 AID）→ 分化為漿細胞與長壽記憶 B 細胞。加強針再刺激記憶 B 細胞 → 迅速變成漿細胞、大量產生高親和力 IgG → 免疫記憶被轉譯成給藥間隔

• E. coli（原核）→ 無糖基化；用於簡單蛋白如 insulin、growth hormone；便宜、快、產量高
• Pichia pastoris（酵母）→ 簡單糖基化、高產；亦是重組乙型肝炎表面抗原的表達系統
• CHO / HEK293（哺乳動物）→ 複雜、類人糖基化；單抗的標準平台，因為 Fc 糖基化決定效應功能與半衰期
• Sf9（昆蟲細胞）→ 用於 VLP 病毒樣顆粒疫苗
• 質體元件：目標基因用 cDNA（無內含子，細菌不能剪接）；啟動子（原核 T7、哺乳動物 CMV）；選擇標記（抗生素抗性，如 ampicillin）；訊號肽序列；可選標籤（His-tag 鎳柱、Fc-tag 蛋白 A）
• 轉化 → 質體進入宿主（熱休克或電穿孔）
• 表達規模 → 小規模搖瓶；大規模用攪拌式發酵罐與一次性波浪式反應器
• 誘導 → 加入誘導物；E. coli 用 IPTG，部分真核系統用 tetracycline
• 製程控制 → 溫度、pH、溶氧、營養補料；補料即 fed-batch：培養過程中逐步加營養，而非一開始一次加足 → 提高細胞密度與效價
• 純化 → 先親和層析（蛋白 A 抓 Fc）→ 一步達 > 95% 純度；再離子交換（IEX，淨電荷）、尺寸排阻（SEC，大小，去聚集體）、疏水作用（HIC，拋光去錯配二聚體）

• 一級 → 線性胺基酸序列（N 端到 C 端）。Anfinsen 原則：摺疊資訊存在序列之中，一級結構決定以上所有層級
• 二級 → 只涉及主鏈局部排列。α-螺旋：右手螺旋、每圈 3.6 個殘基、第 i 位羰基氧與第 i+4 位醯胺氫形成氫鍵；β-摺板：平行或反平行股，靠股間氫鍵穩定
• 三級 → 整條鏈的整體摺疊，靠疏水作用、離子鍵、氫鍵、二硫鍵（唯一共價力）穩定 → 造出功能位點：酵素活性中心、抗體結合位
• 四級 → 獨立摺疊的鏈以非共價方式組裝。課堂例子：haemoglobin 的 α2β2 四聚體、抗體 IgG（2 重鏈 + 2 輕鏈）
• 誘導契合 induced fit → 蛋白不是剛體：結合受質或配體時改變構象，而這個改變本身就是機制 → 酵素藉此大幅加速反應；受體改變構象活化胞內結構域（如酪胺酸激酶）；通道蛋白在開／關間切換控制離子流
• 錯誤摺疊疾病 —— 阿茲海默症的 β-amyloid → 摺錯的蛋白失去功能並產生毒性。對策：穩定功能構象或阻斷致病構象變化。變性 = 失去形狀 = 失去功能 —— 這也是耐 60–80 °C 的 nanobody 屬例外的原因
• PEG 化 → 把聚乙二醇接到蛋白上，增大水動力半徑 → 腎清除變慢 → 半衰期延長、給藥間隔拉長、免疫原性下降
• Krystexxa（重組 uricase） → 把尿酸轉成溶解度高得多的 allantoin；慢性痛風用，每 2 週靜脈輸注。其免疫原性源於來源本身：重組蛋白來自豬–牛嵌合體 → 可誘發中和抗體 → 因此輸注前須抗組織胺 + 類固醇預處理。用其他物種蛋白解決酵素缺乏，卻製造出免疫原性問題

兩條路是什麼：從頭合成 de novo ＝ 從零開始打造核苷酸（胺蝶呤就是在 DHFR 這裡把它截斷）；補救途徑 salvage ＝ 回收現成鹼基，而這條路需要 HGPRT。

回頭對照上面的命運表，整個篩選就收斂成一句話：胺蝶呤拿走第一條路，所以要活就得走第二條；第二條路需要 HGPRT；B 細胞給 HGPRT、骨髓瘤給永生 —— 只有融合細胞兩者兼備。

有兩個性質在起作用。唯一性代表用其中一種酶切開時，環狀質體只會在一處斷開，而不會被切得粉碎。多樣性代表插入片段與載體可以各用一種不同的酶，迫使插入方向具方向性而非隨機 —— 基因若接反了，轉錄出來就是廢序列。

它在流程中的位置就是上面已讀過的那條：質體（載體選擇 ＋ 經 MCS 插入基因）→ 轉形 → 表現 → 純化。現在的選殖常用 Gibson assembly 或 Golden Gate 取代它，但考試要的仍是 MCS 這個詞。